Post on 22-Aug-2019
transcript
Aus der Abteilung für Immunologie
(Leiterin Prof. Dr. med. Barbara M. Bröker)
dem Institut für Immunologie und Transfusionsmedizin
der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Thema: Die Rolle Foxp3-positiver regulatorischer T-Zellen in der murinen
Sepsis
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2010
vorgelegt von:
Matthias Rath
geb. am: 13. Februar 1986
in: Lübz
II
Dekan: Prof. Dr. Heyo K. Kroemer
1. Gutachter: Prof. Dr. Barbara M. Bröker
2. Gutachter: Prof. Dr. Jochen Hühn
Ort, Raum: Greifswald, Besprechungsraum der Klinik für Anästhesiologie und
Intensivmedizin
Tag der Disputation: 23.04.2013
III
Meiner Familie und meinem Lebensgefährten Erik -
Ich danke Euch für die Unterstützung in schweren Zeiten.
Inhaltsverzeichnis
IV
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................................. IV
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................................... VIII
1 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 1
1.1 SEPSIS, SIRS UND INTRA-ABDOMINELLE INFEKTIONEN ................................................................... 1
1.1.1 Definitionen ....................................................................................................................................... 1
1.1.2 Epidemiologie und Prognose ...................................................................................................... 3
1.1.3 Die abdominelle Sepsis .................................................................................................................. 4
1.1.4 Immunregulationsmechanismen in der Sepsis ................................................................... 4
1.2 REGULATORISCHE T-ZELLEN (TREGS) ............................................................................................... 7
1.2.1 Bedeutung der Tregs für die Immunhomöostase .............................................................. 7
1.2.2 Phänotyp der Tregs ........................................................................................................................ 8
1.2.3 Subtypen von Tregs und ihre Entwicklung .......................................................................... 9
1.2.4 Mechanismen der Immunmodulation durch Tregs ....................................................... 10
1.3 REGULATORISCHE T-ZELLEN IN MIKROBIELLEN INFEKTIONEN .................................................... 13
1.3.1 Immunmodulation durch Tregs in mikrobiellen Infektionen ................................... 13
1.3.2 Induktion von Tregs im Rahmen von Infektionen .......................................................... 13
1.3.3 Antigenspezifitäten von Tregs im Kontext mikrobieller Infektionen .................... 14
1.4 INHALT UND ZIELE DER ARBEIT ....................................................................................................... 15
2 MATERIAL .................................................................................................................................. 17
2.1 LABORGERÄTE ..................................................................................................................................... 17
2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................................................................... 18
2.3 ZELLBIOLOGISCHE ARBEITEN ............................................................................................................ 19
2.3.1 Reagenzien und Chemikalien .................................................................................................. 19
2.3.2 Medien, Puffer und Lösungen .................................................................................................. 21
2.3.3 Kits ...................................................................................................................................................... 21
2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE ARBEITEN .................................................................................................. 21
2.4.1 Kits ...................................................................................................................................................... 21
Inhaltsverzeichnis
V
2.5 ANTIKÖRPER ....................................................................................................................................... 22
2.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie ........................................................................... 22
2.5.2 Antikörper für die Immunfluoreszenzmikroskopie ....................................................... 23
2.6 TIEREXPERIMENTELLE ARBEITEN .................................................................................................... 24
2.7 DATENBANKEN UND SOFTWARE ....................................................................................................... 25
3 METHODEN ............................................................................................................................... 26
3.1 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN .................................................................................................. 26
3.1.1 Genehmigungen, Tiere und Tierhaltung ............................................................................ 26
3.1.2 Verwendete Mausstämme ........................................................................................................ 26
3.1.3 Typisierung ..................................................................................................................................... 27
3.1.4 Narkose ............................................................................................................................................. 27
3.1.5 In vivo Depletion von Foxp3+ Tregs ...................................................................................... 27
3.1.6 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) ......................................................................... 28
3.1.7 Überlebenskinetiken ................................................................................................................... 28
3.1.8 Bewertung der Symptomschwere in septischen Tieren ............................................... 29
3.1.9 Tötung von Versuchstieren ...................................................................................................... 30
3.1.10 Serumgewinnung und Peritoneallavage ......................................................................... 30
3.1.11 Organexplantation .................................................................................................................... 30
3.1.12 Bakteriologische Untersuchungen ..................................................................................... 31
3.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN ......................................................................................................... 31
3.2.1 Isolation muriner Splenozyten ............................................................................................... 31
3.2.2 Zellzahlbestimmungen und Vitalitätsprüfung ................................................................ 32
3.2.3 Färbungen für die durchflusszytometrischen Analysen .............................................. 32
3.3 HISTOLOGISCHE METHODEN ............................................................................................................. 34
3.3.1 Herstellung von Kryostatschnitten ....................................................................................... 34
3.3.2 Immunfluoreszenzmikroskopische Dreifachfärbung von
CD4/Foxp3/CTLA-4 ................................................................................................................................... 34
3.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN ............................................................................................... 35
3.4.1 Bestimmung der Zytokinkonzentrationen in Serum und Lavage ........................... 35
3.4.2 Luminexmessung zur Bestimmung der Serumkonzentrationen von
IL-9 und IL-17 ............................................................................................................................................. 35
3.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG ............................................................................................................ 36
Inhaltsverzeichnis
VI
4 ERGEBNISSE .............................................................................................................................. 37
4.1 EXPERIMENTELLE VORARBEITEN ..................................................................................................... 37
4.1.1 Prophylaktische Depletion von Tregs in vivo ................................................................... 37
4.1.2 Ansatz zur verzögerten Depletion von Tregs ................................................................... 38
4.1.3 Einfluss von Diphtherietoxin auf das bakterielle Wachstum .................................... 40
4.2 GRÖßE UND AKTIVIERUNGSSTATUS DER FOXP3+ TREG-POPULATION IN DER CASP ................. 40
4.3 EINFLUSS DER FOXP3+ TREGS AUF DEN SCHWEREGRAD DER POLYMIKROBIELLEN SEPSIS ........ 42
4.3.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell. ......................................... 42
4.3.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion ................................ 43
4.4 EINFLUSS DER FOXP3+ TREGS AUF DIE BAKTERIELLE CLEARANCE UND DEN INFLUX VON
INNATEN IMMUNZELLEN INS PERITONEUM NACH CASP .......................................................................... 44
4.4.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell .......................................... 44
4.4.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion ................................ 47
4.5 EINFLUSS DER FOXP3+ TREGS AUF DEN AKTIVIERUNGSSTATUS DES IMMUNSYSTEMS
UNTER BASALEN UND SEPTISCHEN BEDINGUNGEN .................................................................................... 49
4.5.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell .......................................... 49
4.5.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion ................................ 52
4.6 UNTERSUCHUNGEN ZUM AUSSCHLUSS EINER TRANSIENTEN FOXP3+-EXPRESSION IN
AKTIVIERTEN TEFF-ZELLEN......................................................................................................................... 56
4.7 SERUMKONZENTRATIONEN VON IL-9 UND IL-17 IN DER SEPSIS ................................................. 58
5 DISKUSSION .............................................................................................................................. 60
5.1 GRÖßE UND AKTIVIERUNGSSTATUS DER TREG - POPULATION IM KONTEXT EINER
POLYMIKROBIELLEN SEPSIS ......................................................................................................................... 60
5.2 ROLLE UND FUNKTION DER FOXP3+ TREGS IN DER MURINEN SEPSIS .......................................... 63
5.3 WARUM HABEN HOCHGRADIG AKTIVIERTE TREGS KEINEN EINFLUSS AUF DIE
IMMUNANTWORT IN DER SEPSIS? ............................................................................................................... 66
6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................. 70
7 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................... 72
8 ANHANG: .................................................................................................................................... 79
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................................ 81
Inhaltsverzeichnis
VII
DANKSAGUNG ................................................................................................................................. 83
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG .............................................................................................. 85
LEBENSLAUF .................................................................................................................................... 86
Abkürzungsverzeichnis
VIII
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest. Aqua bidestillata
AK Antikörper
APC Antigen-präsentierende Zelle
bzw. beziehungsweise
CASP Colon Ascendens Stent Peritonitis
CBA Cytometric Bead Array
CD Differenzierungsantigen
(cluster of differentiation)
CFU Kolonie-bildende Einheiten
(colony forming units)
CLP Cecal ligation and puncture
CTLA-4 Zytotoxisches T-Lymphozyten Antigen - 4
(cytotoxic T lymphocyte antigen - 4)
DC Dendritische Zelle
DT Diphtherie-Toxin
DTR Diphtherie-Toxin-Rezeptor
eGFP verstärktes grün-fluoreszierendes Protein
(enhanced green fluorescent protein)
FACS Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
(fluorescence activated cell sorting)
FCS Fötales Kälberserum
(fetal calf serum)
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
Foxp3 Forkhead box P3
G Gauge
GITR Glukokortikoid-induziertes Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-
verwandtes Protein
(glucocorticoid-induced TNF-Receptor- related protein)
ICOS induzierbarer Kostimulator
(inducible co-stimulator)
Abkürzungsverzeichnis
IX
IDO Indolamin-(2,3)-Dioxygenase
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
INR (internal normalized ratio)
iTreg induzierte regulatorische T-Zelle
KG Körpergewicht
LAG-3 Lympozyten-Aktivierungsgen 3
Mac-3 Makrophagen-Antigen -3
MCP-1 Monozyten chemoattraktives Protein 1
(monocyte chemoattractant protein 1)
nTreg natürliche regulatorische T-Zelle
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
(phosphate buffered saline)
PE Phycoerythrin
PE-Cy7 Phycoerythrin- Cyanine 7
POD Peroxidase
PTT partielle Thromboplastinzeit
(partial Thromboplastin time)
Rpm Umdrehungen pro Minute
(rounds per minute)
SIRS systemic inflammatory response syndrome
SD Standardabweichung
TCR T-Zell-Rezeptor
Th3 Typ 3 T-Helferzellen
TNF Tumor Nekrose Faktor
(tumor necrosis factor)
TNP Trinitrophenol
TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand
Treg Regulatorische T-Zelle
Tr1 Typ 1 regulatorische T-Zellen
TRITC Tetramethyl-Rhoadamine-Isothiocyanat
TSA Tyramid Signal-Amplifikation
WT Wildtyp
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Sepsis, SIRS und intra-abdominelle Infektionen
Obwohl die 2002 auf dem Kongress der Europäischen Gesellschaft für Intensivmedizin
gegründete „Surviving Sepsis Campaign“ von jährlich 18 Millionen Sepsiserkrankten
weltweit ausgeht [1], ist dieses Krankheitsbild einer deutschen Studie zufolge der breiten
Öffentlichkeit noch immer weitgehend unbekannt [2]. Trotz intensiver Forschungs-
anstrengungen und höchsten intensivmedizinischen Behandlungsstandards konnte in den
letzten Jahrzehnten kein entscheidender Durchbruch in der Reduktion der Sepsismortalität
erreicht werden. Allein in Deutschland sterben noch immer etwa 60.000 Menschen jährlich an
dieser schweren Form der generalisierten Infektion [3]. Aufgrund der offensichtlichen
Diskrepanz zwischen der medizinischen und gesamtgesellschaftlichen Bedeutung auf der
einen und der öffentlichen Wahrnehmung auf der anderen Seite scheint es gerechtfertigt, die
Sepsis als völlig unterschätztes Krankheitsbild zu bezeichnen.
1.1.1 Definitionen
Da am Anfang der wissenschaftlichen Auseinandersetzung mit einer Krankheit immer die
eindeutige Definition derselben stehen muss, soll im Folgenden auf die klinisch verbreiteten
und oft überlappend verwendeten Bezeichnungen der Sepsis und des Systemic Inflammatory
Response Syndroms (SIRS) eingegangen werden.
Das 1992 auf der Sepsis Konsensus-Konferenz eingeführte Konzept des SIRS [4] zeichnet
sich durch das Vorliegen von mindestens zwei der folgenden Kriterien aus: 1. Fieber bzw.
Hypothermie, 2. Tachykardie, 3. Tachypnoe und 4. Leukozytose bzw. Leukopenie (nähere
Einzelheiten: siehe Tabelle 1). Dabei ist das Auftreten einer Infektion als Ursache dieser
systemischen Entzündungsreaktion nicht zwingend notwendig, da auch schwere primär
abakterielle Entzündungen wie Pankreatitiden und Verbrennungen zum klinischen Bild des
SIRS führen können [4]. Obwohl dieses Konzept mit den neuen Definitionen der
Internationalen Sepsis Konferenz von 2001 als offiziell zu unspezifisch verlassen wurde, gilt
es weiterhin als klinisch sehr praktikabel. Entsprechend wird seine Anwendung zur Diagnose
der schweren Sepsis und des septischen Schocks durch die Leitlinien der Deutschen
Sepsis-Gesellschaft e.V. und der Deutschen Interdisziplinären Vereinigung für Intensiv- und
Notfallmedizin weiter empfohlen [3].
Einleitung
2
Demgegenüber kann die Sepsis entsprechend den Empfehlungen der Sepsis Konferenz von
2001 abgegrenzt werden als eine systemische Entzündungsreaktion, welche im Rahmen einer
mikrobiologisch nachgewiesenen oder klinisch vermuteten Infektion auftritt [5, 6]. Neben
dem Infektionsnachweis gehören dabei zu den Diagnosekriterien der Sepsis wiederum das
Vorliegen von klassischen Entzündungsparametern und pathologischen Organdysfunktions-,
Gewebeperfusions- und hämodynamischen Merkmalen, wie sie auch bei dem abakteriellen
SIRS gefunden werden (Tabelle 1) [7-9].
1. Nachweis der Infektion
Diagnose der Infektion über den mikrobiologischen Nachweis oder durch klinische Kriterien
2. Systemic Inflammatory Response Syndrom (SIRS) (mind. 2 Kriterien)
Fieber ( 38 °C) oder Hypothermie ( 36 °C)
Tachykardie (Herzfrequenz 90 Schläge/min)
Tachypnoe (Frequenz 20/min) oder Hyperventilation (PaCO2 4,3 kPa/ 33 mmHg)
Leukozytose ( 12000/mm3) oder Leukopenie ( 4000/mm3) oder 10 % unreife
Neutrophile im Differentialblutbild
3. Akute Organdysfunktion (mind. 1 Kriterium)
Akute Enzephalopathie: eingeschränkte Vigilanz, Desorientiertheit, Unruhe, Delirium
Relative oder absolute Thrombozytopenie (Abfall der Thrombozyten um mehr als 30 %
innerhalb von 24 h oder Thrombozytenzahl unter 100.000/mm3. Akute Blutungen oder
immunologische Ursachen müssen ausgeschlossen sein.
Renale Dysfunktion: Eine Diurese von 0,5 ml/kg/h für wenigstens 2 h trotz ausreichender
Volumensubstitution und/oder Anstieg des Serumkreatinins > 2x oberhalb des üblichen
Referenzbereiches
Metabolische Azidose: Base Excess -5 mmol/l oder eine Laktatkonzentration
> 1,5x oberhalb des üblichen Referenzbereiches
Arterielle Hypoxämie: PaO2 10 kPa unter Raumluft oder ein PaO2/FiO2-Verhältnis von
33 kPa unter Sauerstoffapplikation. Manifeste Herz- oder Lungenerkrankungen müssen
als Ursache ausgeschlossen sein
Sepsis: Kriterien 1 und 2
Schwere Sepsis: Kriterien 1, 2 und 3
Septischer Schock: Kriterien 1 und 2 sowie für wenigstens 1 Stunde ein systolischer Blutdruck 90 mmHg
bzw mittlerer arterieller Druck Blutdruck 65 mmHg oder notwendiger Vasopressoreinsatz. Die
Hypotension besteht trotz adäquater Volumengabe und ist nicht durch andere Ursachen zu erklären
Tabelle 1: Diagnosekriterien für die Sepsis entsprechend S-2 Leitlinien der Deutschen Sepsis-
Gesellschaft e.V. und der Deutschen Interdisziplinären Vereinigung für Intensiv- und Notfallmedizin
(mod. nach [3])
Einleitung
3
Entscheidend jedoch ist, dass das klinische Bild der Sepsis als ein Krankheitskontinuum
verstanden werden muss, das in seinen extremen Ausprägungen der schweren Sepsis und des
septischen Schocks mit einer höheren Letalität assoziiert ist. Nach den Empfehlungen der
Expertenkonferenz wird dabei die schwere Sepsis charakterisiert durch zusätzlich zu den
allgemeinen Sepsiskriterien auftretende akute Organdysfunktionen. Davon abgegrenzt wird
der septische Schock, der trotz adäquater Volumensubstitution mit einer persistierenden
Hypotension assoziiert ist [5]. Dennoch ist keines der Diagnosekriterien für die Sepsis
spezifisch, was die Heterogenität des Krankheitsbildes unterstreicht.
1.1.2 Epidemiologie und Prognose
In einer europaweiten Studie zum Auftreten der Sepsis bei akut kranken Patienten
(SOAP-study) wurde gezeigt, dass nahezu jeder dritte Patient, der in eine Intensivstation
(ITS) eingeliefert wird, während seiner Hospitalisierung an einer Sepsis erkrankt [6, 10]. Für
Deutschland bedeutet dies eine Inzidenz von 154.000 Sepsiserkrankungen pro Jahr. Davon
sind 75.000 Patienten durch die gefährlichen Komplikationen einer schweren Sepsis oder
eines septischen Schocks bedroht [3, 11].
Sepsis geht vor allem von Pneumonien, Blutstrominfektionen, Infektionen des
Urogenitaltraktes, intra-abdominellen und chirurgischen Wund- sowie Weichteilinfektionen
aus oder ist mit intravasalen Kathetern assoziiert [12]. Das Erregerspektrum dieser
generalisierten Infektionen hat sich in den letzten Jahrzehnten kontinuierlich verändert und zu
einer deutlichen Zunahme von Gram-positiven Bakterien und Pilzen als Infektionsauslösern
geführt, sodass heute etwa 40 % der Sepsisfälle auf Intensivstationen durch Gram-positive
und 38 % durch Gram-negative Bakterien ausgelöst werden [10, 13]. Besonders
problematisch ist das häufige Auftreten von Mischinfektionen bei den auf der Intensivstation
selbst akquirierten Infektionen, welche die Behandlung deutlich erschweren.
Die mit der Sepsis verbundene Mortalität ist individuell schwer vorhersagbar und hängt
entscheidend von dem Schweregrad der Erkrankung ab [14]. Während bei der einfachen
Sepsis etwa 27 % der betroffenen Patienten versterben, ist die Letalität der schweren Sepsis
und des septischen Schocks mit 40 % und 56 % deutlich höher, wie eine neue Studie aus
Deutschland zeigt [8, 9]. Einige Studien sprechen sogar von Letalitäten bis zu 70 % für
Patienten im septischen Schock [9].
Einleitung
4
Die mit Sepsis verbundenen Kosten sind erheblich. Allein die direkten jährlichen Kosten für
die intensivmedizinische Betreuung der Patienten werden auf 1,77 Milliarden Euro
geschätzt [3], womit die Sepsis zu den teuersten Erkrankungen im deutschen Gesundheits-
system gehört [7, 8, 15, 16].
1.1.3 Die abdominelle Sepsis
Intraabdominelle Infektionen (IAI) sind eine der Haupttodesursachen auf chirurgischen
Intensivstationen. Insbesondere die healthcare-acquired Infektionen (HA-IAI), deren
Therapie sich durch das häufige Auftreten von mehrfach resistenten Keimen und damit der
Notwendigkeit zur Behandlung mit Breitspektrum-Antibiotika schwierig gestaltet [17], sind
als Komplikation nach viszeralchirurgischen Eingriffen gefürchtet. Da eine Entzündung im
Bauchraum unweigerlich zu einer Mitreaktion von Peritoneum und Darm führt [18], muss
jede intraabdominelle Infektion als potenziell lebensbedrohlich eingestuft werden und bedarf
intensivmedizinischer Behandlung. Mit einer postoperativen Inzidenz von 9-12 % und einer
Letalität von 42-80 % trägt die abdominelle Sepsis als generalisierte Form einer diffusen
Peritonitits wesentlich zur postoperativen Morbidität und Mortalität bei [18, 19].
1.1.4 Immunregulationsmechanismen in der Sepsis
Die Sepsis muss als ein hochgradig komplexes und dynamisches Krankheitsgeschehen
verstanden werden, das sich durch zahlreiche Interaktionen zwischen den eindringenden
pathogenen Mikroorganismen und den Abwehrsystemen des Wirts auszeichnet.
Das volle Ausmaß dieser zahlreichen Wechselwirkungen und die Gründe für die
Entgleisungen der Immunhomöostase sind nicht ausreichend verstanden. Während die
Bedeutung einer schnellen und effektiven anti-mikrobiellen Therapie für den
Behandlungserfolg der Sepsis unbestritten ist, muss das Bewusstsein für die Rolle und
Bedeutung des Wirts in diesem Prozess noch weiter gestärkt werden. Einige Autoren gehen in
diesem Zusammenhang soweit zu postulieren, dass die Letalität der Sepsis weniger durch den
direkten Einfluss der Pathogene als vielmehr durch die komplexe immunologische Reaktion
des Wirts verursacht wird [20].
Die systemische Abwehrreaktion des Wirts auf die generalisierte Infektion verläuft in der
Sepsis biphasisch. Zu Beginn überwiegt die Hyperinflammation, die sich durch hohe
systemische Konzentrationen der proinflammtorischen Zytokine IL-1, TNF und IL-6
auszeichnet, im späteren Sepsisverlauf folgt meist eine hypoinflammatorische Phase, in
Einleitung
5
welcher hohe Spiegel der antiinflammatorischen Zytokine IL-10, TGF- und IL-4 im
Organismus zu finden sind [21-23] (Abbildung 1).
Abbildung 1: Biphasischer Verlauf der systemischen Immunantwort in der Sepsis. Adaptiert
nach Hotchkiss et al. [22] und Grimminger et al. [21].
Insbesondere, aber nicht ausschließlich Zellen des angeborenen Immunsystems wie
Makrophagen und neutrophile Granulozyten, welche die erste Front der zellulären Abwehr
darstellen, tragen in hoher Dichte Rezeptoren zur Erkennung von konservierten Strukturen
von Pathogenen auf ihrer Oberfläche und können innerhalb kurzer Zeit aktiviert werden [24].
Sie sezernieren dann große Mengen proinflammatorischer Zytokine, welche verschiedene
Mediatorkaskaden des Immun-, des Gerinnungs- und des neuroendokrinen Sytems
anschalten.
In der Konsequenz wird von verschiedenen Zellen die Produktion von Zytokinen wie
beispielsweise TNF, IFN und IL-12, aber auch von Leukotrienen, Prostaglandinen,
Hormonen und Enzymen (Proteasen, Elastasen) stark hochreguliert [25].
Aus diesen Gründen wurde in verschiedenen klinischen Studien (z. B. mit Kortikosteroiden
[26] oder IL-1-Rezeptorantagonisten [27]) versucht den „Zytokinsturm“ in der frühen
Hyperinflammation zu blockieren, um so das Überleben der Sepsispatienten zu verbessern. In
Placebo-kontrollierten Untersuchungen konnten hierdurch jedoch keine signifikanten
Überlebensvorteile gezeigt werden, obwohl präklinische Untersuchungen im Tiermodell sehr
vielversprechende Ergebnisse zeigten [26, 27].
Auf der Suche nach Ursachen für diese Fehlschläge wurden auch die kompensatorischen
antiinflammatorischen Mechanismen und die Rolle des erworbenen Immunsystems in den
Einleitung
6
Blick genommen, welche bisher eher im Hintergrund gestanden hatten. Vorarbeiten aus
unserem Labor zeigten im murinen Sepsismodell einer generalisierten, diffusen Peritonitis,
dass CD4-positive T-Lymphozyten innerhalb von Stunden nach der Induktion der Sepsis
systemisch aktiv werden und die lokale Immunantwort begrenzen. Diese Zellen hemmen
folglich die effektive Eindämmung einer systemischen Streuung der Bakterien und
beeinflussen das Überleben negativ [28]. Welche spezifische Subpopulation der
CD4+ T-Zellen (Th1, Th2, Th17, regulatorische T-Zellen) dafür verantwortlich ist, ist nicht
bekannt.
Die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen legen nahe, dass ein Zusammenspiel von
zellulären Mechanismen, z. B. eine Immunsuppression durch Tregs und/oder eine durch
Apoptose in der Sepsis ausgelöste Anergie von Effektorzellen für die gefährliche
Immunparalyse bei Sepsis verantwortlich ist [22].
Da unter intensivmedizinischer Betreuung inzwischen weniger Sepsispatienten im initialen
Zytokinsturm versterben, sind sie besonders durch den Verlust ihrer Immunkompetenz und
durch schwere Sekundärinfektionen gefährdet [22, 29]. Eine Aufgabe in Zukunft besteht
folglich darin, eine individualisierte Therapie für Sepsispatienten zu entwickeln, die die
unterschiedlichen Phasen der Erkrankung berücksichtigt. Um dieses Ziel zu erreichen und
neue Therapieansätze zu identifizieren, müssen wir verstehen, welche Zellen eine protektive
Immunreaktion begrenzen und wie durch eine gezielte lokale Aktivierung der anti-
bakteriellen Abwehrmechanismen ein besseres Überleben erreicht werden kann.
Einleitung
7
1.2 Regulatorische T-Zellen (Tregs)
Das Immunsystem ist dafür ausgelegt, den Wirt effektiv vor Infektionen durch eindringende
pathogene Mikroorganismen zu schützen. Das interaktive und hoch komplexe Netzwerk der
verschiedenen Abwehrzellen muss dabei präzise reguliert werden, um Gewebeschäden durch
überschießende Immunantworten gegen Pathogene oder Allergene auf der einen sowie
Angriffe gegen lebensnotwendige kommensale Darmbakterien und gegen Selbstantigene auf
der anderen Seite zu verhindern [30, 31].
1.2.1 Bedeutung der Tregs für die Immunhomöostase
Dass neben passiven auch aktive zellvermittelte Regulationsmechanismen zur Begrenzung
einer Immunantwort und zur Aufrechterhaltung einer Selbst-Toleranz von entscheidender
Bedeutung sind, wurde seit langem vermutet [32, 33]. Heute ist die aktive Immunmodulation
durch eine Subpopulation der CD4-positiven T-Lymphozyten, die regulatorischen T-Zellen
(Treg), gut dokumentiert [30, 34, 35]. Es gibt immer mehr Hinweise dafür, dass diese
Regulatoren neben der Verhinderung von Autoimmunerkrankungen weitere mannigfaltige
Funktionen besitzen. Sie leisten einen wichtigen Beitrag zur Unterdrückung von Asthma und
Allergien, zur Induktion von Toleranz gegenüber Nahrungsantigenen, zur maternalen
Immuntoleranz gegenüber dem Fetus, zur Hemmung einer Immunantwort gegen kommensale
Mikroorganismen im Darm und zur Verhinderung der Aktivierung von T-Zellen durch
schwache antigene Stimuli sowie schließlich zur Feedback-Kontrolle einer durch T-Helfer-
Zellen vermittelten Effektorantwort [36].
In Anbetracht dieser zahlreichen Aufgaben in der Immunhomöostase ist es nicht erstaunlich,
dass der Verlust dieser Zellen mit schwerwiegenden pathologischen Dysregulationen und
Autoimmunerkrankungen assoziiert ist. So entwickelt sich bei Mäusen ohne regulatorische
T-Zellen ein als scurfy bezeichneter Phänotyp, der sich durch massive Lymphoproliferation
und durch multiple Autoimmunreaktionen in zahlreichen Organsystemen manifestiert [37-39]
und innerhalb von wenigen Wochen zum Tode führt. Beim Menschen entspricht diesem
Phänotyp das sogenannte IPEX-Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy,
enteropathy, X-linked syndrome), ebenfalls eine schwere genetische Erkrankung [40, 41].
Diese Symptomkomplexe verdeutlichen die herausragende Rolle der Tregs und haben einige
Autoren veranlasst, diese Zellpopulation als „Meister der Regulation“ oder „Hüter des
Lebens“ zu bezeichnen [42, 43].
Einleitung
8
1.2.2 Phänotyp der Tregs
Zunächst wurden Tregs experimentell durch das Oberflächenmolekül CD25 charakterisiert.
Jedoch ist CD25 auf Tregs zwar in hoher Dichte konstitutiv exprimiert, aber nicht spezifisch
für diese T-Zellen [44, 45]. Einerseits regulieren konventionelle T-Lymphozyten nach
Aktivierung CD25 hoch [46, 47], andererseits wurden in speziellen Geweben, wie
beispielsweise im Darm, CD25-negative Tregs beschrieben [48].
Als spezifischster Marker für Tregs gilt heute das X-chromosomal kodierte Forkhead box p3
Protein (Foxp3) [49-51], welches zur Gruppe der Forkhead-Transkriptionsfaktoren gehört.
Ihm wird eine zentrale Rolle in der Entwicklung, Funktion und Homöostase der Tregs
zugesprochen [50, 52, 53].
Obwohl derzeit kein einzelner spezifischer Oberflächenmarker für Tregs bekannt ist, gibt es
doch ein charakteristisches Expressionsprofil von Molekülen auf der Oberfläche von Tregs,
welche in ihrer Gesamtheit und in Verbindung mit Foxp3 [50] im Zellkern eine sichere
Charakterisierung der Tregs erlauben. So exprimieren Tregs schon unter homöostatischen
Bedingungen verschiedene Effektormoleküle, wie das zytotoxische T-Lymphozyten
Antigen 4 (CTLA-4), den Glukokortikoid-induzierten Tumor-Nekrose-Faktor-
Rezeptor (GITR), das Lymphozyten-Aktivierungs-Gen 3 (LAG-3), CD39 und CD73,
außerdem eine Reihe von kostimulatorischen Molekülen wie CD28, CD80/86, CD40, OX40
und 4-1BB und schließlich Chemokinrezeptoren wie CCR4 und CCR8 in hoher Dichte auf
ihrer Oberfläche [52].
Trotzdem bleibt die Isolierung von Foxp3-positiven Tregs schwierig, da nahezu alle diese
Oberflächen-assoziierten Moleküle auch auf aktivierten Effektor-T-Lymphozyten exprimiert
werden können [28]. Zudem wird durch neuere Studien die Rolle von Foxp3 als Marker für
Tregs beim Menschen hinterfragt. Diese zeigen, dass Foxp3 in aktivierten T-Zellen transient
hochreguliert wird und nicht zwangsläufig mit einem suppressorischen Potential dieser Zellen
assoziiert zu sein scheint [54, 55]. In der Maus wurde dieses Phänomen bisher nicht
beschrieben, so dass hier Foxp3 nach wie vor als Marker für Treg angesehen wird.
Von großer Bedeutung für die Rolle von regulatorischen T-Zellen, insbesondere bei der
Begrenzung von Gewebeschäden durch Mechanismen der Infektabwehr, ist die Tatsache, dass
Tregs nicht nur über ihren T-Zell-Rezeptor aktiviert werden können. Vielmehr konnten
verschiedene Studien zeigen, dass diese Zellen verschiedene Toll-like-Rezeptoren, darunter
TLR4, TLR5, TLR7 und TLR8 in hoher Dichte sowie geringe Mengen von TLR1, 3, 5 und 9,
als auch andere Pattern Recognition Rezeptoren (PRRs) exprimieren [56, 57]. Dadurch sind
Einleitung
9
sie in der Lage, hoch konservierte Strukturen von verschieden Mikroorganismen und
endogene Gefahrensignale, wie z. B. Stressproteine, zu erkennen, und sie können Antigen-
unabhängig aktiviert werden.
1.2.3 Subtypen von Tregs und ihre Entwicklung
CD4-positive Tregs werden heute nach ihrem Entwicklungsort in zwei große Gruppen
eingeteilt:
Natürliche regulatorische T-Zellen (nTreg)
Natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs) entwickeln sich aus lymphoiden Vorläufer-
Zellen des Knochenmarks und reifen im Zuge der positiven und negativen Selektion im
Thymus. Sie weisen ein breites Repertoire an T-Zellrezeptor-Spezifitäten für Selbst-
Antigene auf [58]. In der Peripherie machen sie etwa 5-10 % der CD4-positiven
T-Lymphozyten aus [59, 60] und ihr Verlust führt im Mausmodell zu katastrophalen
Autoimmunerkrankungen mit schweren Entgleisungungen des immunologischen
Gleichgewichts durch Ausfall der peripheren Selbsttoleranz [37, 39].
Induzierte regulatorische T-Zellen (iTreg)
Eine zweite Gruppe von regulatorischen T-Zellen entsteht unter speziellen Bedingungen
durch Konversion außerhalb des Thymus in sekundären lymphatischen Organen aus
konventionellen nicht-regulatorischen T-Zellen [52]. Diese Zellen, welche zumindest
teilweise Foxp3-negativ bleiben [52, 58, 59, 61], werden als adaptive oder induzierte
Tregs bezeichnet [62]. Zu dieser heterogenen Population von Zellen mit
suppressorischem Potential gehören sowohl Typ 1 regulatorische T-Zellen (Tr1), die
durch Antigenstimulation in Anwesenheit von IL-10 induziert werden, als auch Typ 3
T-Helfer-Zellen (Th3), welche durch geringe Dosen von oral applizierten Antigenen in
Anwesenheit von TGF- induziert werden können und selbst über die lösliche oder
membrangebundene Form dieses Zytokins suppressorisch wirken [63]. Daneben wurde
von einigen Autoren auch die Existenz von IL-10+ TGF-+ CD4+ Tregs und
verschiedenen CD8-positiven suppressorischen T-Lymphozyten beschrieben [59]. Im
Unterschied zu nTregs ist die T-Zell-Rezeptorspezifität der iTregs oft auf einen
bestimmten Zelltyp beziehungsweise wenige Tumor- oder Fremdantigene beschränkt.
Einleitung
10
Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz und
der Begrenzung von Gewebeschäden bei chronischen Infektionen. Von zentraler
Bedeutung ist dies in der Darmmukosa und im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe
(GALT) [58].
1.2.4 Mechanismen der Immunmodulation durch Tregs
Zu den Zielzellen der Treg-vermittelten Suppression gehören neben CD4+ und
CD8+ T-Lymphozyten auch eine Reihe weiterer Effektorzellen wie dendritische Zellen,
B-Zellen, Makrophagen, Osteoblasten, Mast-Zellen, NK- und NKT-Zellen [42, 64]. Zur
Hemmung der Proliferation und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen verfügen
Tregs über ein ganzes Arsenal von Möglichkeiten, die Immunantworten des Abwehrsystems
über teilweise Zellkontakt-abhängige und teilweise Zellkontakt-unabhängige Wege zu
dämpfen [65]. Vignali et al. teilen die zahlreichen suppressorischen Mechanismen von Tregs
nach den ihnen zugrunde liegenden Prinzipien in vier große Gruppen ein [58, 66] (Abbildung
2):
1. Suppression durch Ausschüttung von inhibitorischen Zytokinen
Zahlreiche in vitro Studien haben die Bedeutung des direkten Zell-Zell-Kontaktes zur
Entfaltung des suppressorischen Potentials von Tregs belegt [66, 67]. Dennoch gibt es
immer mehr Hinweise dafür, dass in vivo auch die Ausschüttung von inhibitorischen
Zytokinen durch Tregs entscheidend ist [31, 64]. Obwohl ihr jeweiliger Beitrag im
Einzelfall noch kontrovers diskutiert wird, ist die generelle Bedeutung der inhibitorischen
Zytokine IL-10 und TGF-, die in großen Mengen insbesondere von iTregs produziert
werden, für die Treg-vermittelte Kontrolle von Entzündung und homöostatischer
Expansion von Immunzellen durch zahlreiche in vivo Modelle gesichert [65, 68]. Mit
IL-35 wurde durch Vignali et al. ein neues Mitglied in der Gruppe der inhibitorischen
Zytokine beschrieben, das sowohl in vivo als auch in vitro für die Suppression durch
Tregs wichtig zu sein scheint [69]. So verringert der Verlust von IL-35 die
suppressorische Kompetenz von Tregs drastisch [65].
2. Suppression durch Veränderung der metabolischen Aktivität der Zielzelle
Neben inhibitorischen Zytokinen wurde auch die Modulation der metabolischen Aktivität
von Effektorzellen durch die intra- oder extrazelluläre Ausschüttung von Adenosin-
Einleitung
11
Nukleosiden als ein Suppressionsmechanismus von Tregs beschrieben [66]. Tregs
exprimieren die Oberflächenmoleküle CD39 und CD73, welche durch ihre Enzymaktivität
Adenosin extrazellulär freisetzen, so dass es in der Umgebung der Zelle akkumuliert.
Adenosin entfaltet seine suppressorische Wirkung auf die Zielzelle durch Bindung an
Typ 1 purinerge Adenosin-Rezeptoren [70]. Des Weiteren scheint auch zyklisches
Adenosin-Monophosphat (cAMP), welches über Gap Junctions von Tregs in Effektor-
Zellen eindringt und dort als potenter Second Messenger wirkt, an der direkten
Suppression der Zielzelle beteiligt zu sein [71].
Einer der wichtigsten Wege, den Tregs für ihre Suppression nutzen, ist der Verbrauch von
IL-2, welches einen wichtigen anti-apoptotischen Stimulus für Effektorzellen darstellt. Da
Tregs die -Kette des IL-2-Rezeptors (CD25) in hoher Dichte auf ihrer Oberfläche
exprimieren, sind sie in der Lage große Mengen IL-2 zu binden. Dadurch entsteht bei
Teff-Zellen ein IL-2-Mangel, welcher eine Bim-vermittelten Apoptose der Zielzelle
auslöst [64]. Diese Form der Apoptose wird auch „Tod durch Vernachlässigung“ genannt.
3. Suppression durch Modulation der Funktion von Antigen-präsentierenden dendritischen
Zellen
Neben der direkten inhibitorischen Wirkung von Tregs auf ihre Zielzellen supprimieren
sie diese auch indirekt, indem sie die Reifung und Funktion von Antigen-präsentierenden
Zellen (APC) hemmen [66]. Dies geschieht durch einen Wettbewerb mit Effektor-Zellen
um APC-Bindungsstellen und durch direkte Veränderung der APC-Funktionen über
Interaktion verschiedener Oberflächenmoleküle. Durch die Bindung von CTLA-4,
welches konstitutiv auf Tregs exprimiert wird, an CD80/86 auf dendritischen Zellen (DC)
kommt es beispielsweise zur Aktivierung der Indolamin-(2,3)-Dioxygenase (IDO) in DCs,
welche die essentielle Aminosäure Tryptophan enzymatisch in ihr pro-apoptotisches
Abbauprodukt Kynurenin umsetzt. Da Tryptophan für Teff-Zellen einen
lebensnotwendigen proliferativen Stimulus darstellt, kommt es durch dessen Mangel
schnell zur Induktion des Zelltodes in Teff-Zellen [72, 73]. Auch die Inhibition der
Reifung von DCs durch die Bindung von LAG3 an MHC-II-Moleküle auf unreifen DCs
scheint einen Beitrag zur indirekten Suppression zu leisten [66].
4. Suppression durch Induktion von Zytolyse oder Apoptose in der Zielzelle
Regulatorische T-Zellen verfügen letztendlich auch über eine Reihe von Möglichkeiten
zur direkten Induktion des Zelltodes in den Zielzellen. So können CD4+Foxp3+ Tregs zum
Einleitung
12
Beispiel nach Aktivierung die Expression von Granzym A hochregulieren und so
Zielzellen über einen Perforin-abhängigen Mechanismus in den Zelltod schicken [66].
Neuere Studien belegen auch die Fähigkeit von Tregs, Apoptose in Zielzellen über
TRAIL-abhängige und Galectin-1-abhängige Mechanismen zu induzieren [74].
Die Frage, ob ein einzelner Mechanismus für die Funktion der Tregs entscheidend ist oder ob
immer ein Zusammenspiel verschiedener Suppressionswege nötig ist, ist bis heute schwer zu
beantworten.
Bei der Betrachtung der suppressorischen Mechanismen von Tregs ist allerdings von
besonderer Bedeutung, dass sie zwar zumeist Antigen-spezifisch über ihren T-Zell-Rezeptor
aktiviert werden müssen, die von ihnen getragene Suppression von Effektorzellen jedoch
Antigen-unspezifisch ablaufen kann. Das heißt, dass nach dem Prinzip der bystander
suppression einmal aktivierte Tregs Teff-Zellen mit vielen verschiedenen Antigenspezifitäten
inhibieren können [42].
Abbildung 2: Mechanismen der Tregs zur Suppression von Effektor-T-Lymphozyten (Teff). Modifiziert
nach Vignali et al. [52, 58, 66]
Einleitung
13
1.3 Regulatorische T-Zellen in mikrobiellen Infektionen
1.3.1 Immunmodulation durch Tregs in mikrobiellen Infektionen
In Anbetracht der bisher beschrieben vielfältigen immunsuppressiven Mechanismen und der
Bedeutung der Tregs für die Begrenzung von Immunantworten stellt sich die Frage, ob und
wie unter diesen Bedingungen eine effektive Abwehr von pathogenen Mikroorganismen
durch den Wirt überhaupt möglich ist.
Verschiedene Autoren haben vermutet, dass Tregs eine zweischneidige Funktion im Rahmen
einer mikrobiellen Infektion haben, indem sie auf der einen Seite übermäßige kollaterale
Gewebeschäden durch die Abwehrmechanismen des Immunsystems verhindern, auf der
anderen Seite dadurch aber auch eine effektive Kontrolle der Infektion beeinträchtigen und
eine Langzeit-Persistenz der Pathogene fördern können [48]. So konnte beispielsweise in
murinen Infektionsmodellen mit Helicobacter hepaticus [75], Listeria monocytogenes [76],
Pneumocystis carinii [77], Schistosoma mansoni [78] oder Candida albicans [79] gezeigt
werden, dass CD4+CD25+ Tregs die Immunantwort des angeborenen und erworbenen
Abwehrsystems zum Wohle des Wirts begrenzen und eine Immunpathologie am Ort der
Infektion verhindern. In anderen hauptsächlich parasitären und viralen Infektionen mit
Plasmodium yoelii [80], Plasmodium berghei [81], Litomosoides sigmodontis [82] oder dem
Friend Virus [83] scheinen murine Tregs dagegen jedoch eine ungebremste Vermehrung der
Pathogene durch die Dämpfung einer effektiven Immunantwort zu begünstigen. Man muss
hier schlussfolgern, dass Tregs unter bestimmten Voraussetzungen zu einer persistierend
verlaufenden Infektion führen und das Überleben des Wirts gefährden können.
1.3.2 Induktion von Tregs im Rahmen von Infektionen
Um ihr eigenes Überleben im Wirt zu sichern, haben verschiedene Mikroorganismen im
Laufe der Evolution gelernt, sich aktiv einer effektiven Beseitigung durch das Immunsystem
des Wirts zu entziehen (Immunevasion). Pathogene schaffen dafür durch die
Funktionsmodulation von APCs oder die direkte Beeinflussung von Tregs über Ligation von
Toll-like-Rezeptoren ein Mikromilieu, welches die Rekrutierung und das Überleben von
Tregs am Ort der Infektion fördert und eine Induktion von iTregs begünstigt [48, 84]. So regt
beispielsweise Bordetella pertussis dendritische Zellen zur Produktion und Sekretion von
IL-10 an und schafft so die Voraussetzungen zur Bildung von Tr1-Zellen aus naiven
T-Lymphozyten [85]. Besonders in chronischen Infektionen ist die Fähigkeit von einigen
Pathogenen wie Trypanosoma cruzi [86] oder Plasmodium yoelii [87] bekannt, in
Einleitung
14
dendritischen Zellen neben IL-10 auch eine TGF--Produktion zu induzieren und so eine
Umgebung zu schaffen, welche die periphere Konversion zu Foxp3+ Zellen mit
suppressorischem Potential fördert [48]. Während sich manche pathogene Mikroorganismen
durch Dämpfung einer gegen sie gerichteten Immunantwort eine immunologische Nische
schaffen können, sind unter den Bedingungen einer akuten Infektion die pro-
inflammotorischen Reize meist offenbar so stark, dass eine periphere Foxp3-Induktion in
konventionellen T-Zellen hier nicht stattfindet [48].
1.3.3 Antigenspezifitäten von Tregs im Kontext mikrobieller Infektionen
Während die Frage nach der Antigenspezifität für die in einer Infektion induzierten Tregs
relativ klar zu beantworten ist, bleibt dies für die an der Entzündungsbegrenzung beteiligten
nTregs schwierig. Während iTregs Antigenspezifitäten gegen mikrobielle Antigene
aufweisen [48], erscheint es nach Belkaid et al. naheliegend, dass nTregs, welche im Thymus
reifen und auch dort einer Selektion unterlaufen, in der frühen Phase der Infektion Selbst-
Antigene erkennen, die bei infektionsbedingten Gewebeschäden Tregs auch in der Peripherie
zugänglich werden. Insbesondere im Verlauf chronischer Infektion sind auch Foxp3+ Tregs zu
finden, die mikrobielle Antigene erkennen [78] und nach Bindung an diese stark proliferieren
[88]. Daher schlagen die gleichen Autoren eine Erklärung vor, nach der diese Zellen auf den
Ort der Infektion beschränkt sind und kompartimentalisiert werden, da sie für ihr Überleben
der Präsenz ihres kognaten Antigens bedürfen [48, 88].
Einleitung
15
1.4 Inhalt und Ziele der Arbeit
Trotz moderner Intensivmedizin stellt die abdominelle Sepsis durch Anastomoseninsuffizienz
nach großen viszeralchirurgischen Eingriffen für Patienten noch immer eine
lebensbedrohliche Komplikation dar.
In vorangegangenen Arbeiten aus unserem Labor konnte gezeigt werden, dass insbesondere
CD4-positive T-Lymphozyten schon innerhalb weniger Stunden nach Induktion einer
diffusen Peritonitis im murinen Sepsis-Modell der Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP)
systemisch aktiviert werden, zahlreiche Effektormoleküle hochregulieren und das Überleben
negativ beeinflussen [28]. Durch eine Antikörper-vermittelte Depletion der CD4+ T-Zellen
konnte in diesem Modell nicht nur die bakterielle Dissemination, sondern auch die Letalität in
der Sepsis signifikant gesenkt werden.
Da verschiedene Subpopulationen zu den CD4+ T-Zellen gehören, war unklar, welche davon
für den beobachteten schädlichen Einfluss auf die Immunantwort in der abdominellen Sepsis
verantwortlich ist. Die Hemmung der lokalen Immunantwort, das Zytokinmuster und die
phänotypische Charakterisierung des T-Zell-Kompartiments in der Sepsis ließen eine direkte
Beteiligung der immunmodulatorisch wirkenden CD4+Foxp3+ Tregs an diesem Prozess
vermuten. Bisherige in vivo Untersuchungen zur Aufklärung der Rolle der Tregs im murinen
Sepsismodell der Cecal Ligation and Puncture (CLP) hatten zur Charakterisierung der Tregs
meist auf CD25 zurückgegriffen und kamen zu sehr widersprüchlichen Ergebnissen [89-91].
Die Interpretation dieser Daten ist schwierig, weil CD25 nicht für Treg spezifisch ist. Deshalb
fordern verschiedene Forscher, für die Untersuchung von Infektionsmodellen Foxp3 als
Marker für Tregs zu verwenden [48, 92]. Dies war das Ziel dieser Arbeit.
Es sollte das DEREG-Mausmodell eingesetzt werden, um die Rolle der Foxp3+ Tregs in der
polymikrobiellen Sepsis zu beleuchten. In diesem Mausstamm wird ein Fusionsprotein
bestehend aus eGFP und dem Diphtherietoxin-Rezeptor unter der Kontrolle des Foxp3-
Promotors exprimiert. Dies ermöglicht eine selektive Depletion der Foxp3+ Tregs in vivo und
einfache Charakterisierung ex vivo. Aktuell sind DEREG-Mäuse das beste verfügbare
Mausmodell zur Untersuchung der Funktion der Tregs. Als Sepsismodell wurde die Colon
ascendens Stentperitonitis (CASP) gewählt, weil diese der klinische Situation einer fäkalen
Peritonitis nach chirurgischer Nahtinsuffizienz besonders nahe kommt. Um die systemischen
und lokalen Auswirkungen einer selektiven Depletion der Tregs in diesem Modell zu
charakterisieren, sollten vergleichende Überlebenskinetiken erstellt und Organ- und Serum-
Einleitung
16
proben durchflusszytometrisch, immunfluoreszenzmikroskopisch und bakteriologisch
analysiert werden.
Material
17
2 Material
2.1 Laborgeräte
Analysewaage Sartorius, Göttingen
Auflichtmikroskop Hund, Wetzlar
Autoklaven Tuttnauer Systec, Wettenberg
Bechergläser (100 ml, 200 ml, 500 ml)
Bürker-Zählkammer Optiklabor, Friedrichsdorf
Digitalwaage Sartorius, Göttingen
CO2 – Inkubator WTB – Binder, Tuttlingen
Durchflusszytometer
FACS Scan Becton Dickinson, NJ, USA
FACS Calibur Becton Dickinson, NJ, USA
FACS Aria Becton Dickinson, NJ, USA
Durchlichtmikroskop Carl Zeiss, Jena
Erlenmeyerkolben (200 ml, 500 ml)
Flockeneisbereiter Enodis, Herborn
Fluoreszenzmikrokop Carl Zeiss, Jena
Homogenisator
Ultra-Turrax T25 IKA Werke, Staufen
Inkubationsschüttler New Brunswick Scientific, NJ, USA
Koloniezähler eCount Heathrow Scientific LLC, New Basford,
UK
Kühlschrank Liebherr, Biberach an der Riss
Laborschüttler KL-2 Merck, Darmstadt
Luminex 200 System Bio-Rad Laboratories, München
Magnetrührer Heidolph, Schwabach
Mehrkanalpipetten Eppendorf, Hamburg
Mikrotom-Kryostat Cryostar HM 560 Microm International, Walldorf
Pipetten Eppendorf, Hamburg und Brand,
Wertheim
Material
18
Pipetus-Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
Präparierbesteck
(Schere, Pinzette, Skalpell)
Quarzpipette Biometra, Göttingen
Sicherheitswerkbank Heraeus Instruments, Hanau
Stickstoffbehälter KGW Isotherm, Karlsruhe
Tiefkühlschrank -80° C Heraeus Instruments, Hanau
UV-Photometer Biometra, Göttingen
Vakuum-Pumpe Bio-Rad Laboratories, München
Vortexer Janke & Kunkel IKA Labortechnik,
Staufen
Wasserbad Thermo Haake, Karlsruhe
Zentrifugen
Biofuge pico/ fresco Heraeus Instruments, Hanau
Megafuge 1.0/ 1.0 R Heraeus Instruments, Hanau
Galaxy Mini VWR, Darmstadt
2.2 Verbrauchsmaterialien
Aluminiumfolie
Deckgläschen Langenbrick, Tenningen
Columbia Blutagarplatten BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
EDTA-Vakutainer BD, Heidelberg
Einbettschälchen
Cryomold Tissue Tek intermediate Sakura, Zoeterwoude, Niederlande
End-to-End-Kapillaren Sarstedt, Nümbrecht
Ethilon 4/0 und 7/0 Ethicon, Norderstedt
FACS-Röhrchen BD, Heidelberg
Kanülen Dispomed, Gelnhausen und BD,
(19G x 1½´´, 20G x 1½´´und Erembodegen, Belgien
30G x ½´´)
Klebefolie für Mikrotiterplatten Roth, Karlsruhe
Material
19
Latex-Untersuchungshandschuhe Dahlhausen, Köln
Mikro-Hämatokrit-Kapillaren Brand, Wertheim
Nitril-Handschuhe Ansell, München
Zellkulturplatten (6- und 96- Loch) Greiner, Frickenhausen und NUNC A/S,
Roskilde, Dänemark
Objektträger Superfrost Plus R. Langenbrinck, Emmendingen
Petrischale (10 cm) Greiner, Frickenhausen
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg und Sarstedt,
Nümbrecht
PP-Röhrchen (12 ml und 5 ml, steril) Greiner, Frickenhausen
Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg und Sarstedt,
Nümbrecht
Spritzen (2 ml) B. Braun, Melsungen
Spritzen (10 ml) BD, Erembodegen, Belgien
Tuberkulin-Spritzen (27G ½´) BD, Erembodegen, Belgien
Venenverweilkatheter (16G) BD, Heidelberg
Wachsstift DAKO, Glostrup, Dänemark
Zellsiebe, Nylon (70 μm) BD, Erembodegen, Belgien
Zentrifugenröhrchen (15 ml und 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht und BD, Le Pont De
Claix, Frankreich
2.3 Zellbiologische Arbeiten
2.3.1 Reagenzien und Chemikalien
Aceton Hedinger, Stuttgart
Biotin Blocking-System DAKO, Glostrup, Dänemark
Concanavalin A Sigma, Steinheim
DMSO Sigma, Steinheim
Dulbecco´s PBS PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Einbettmedium Tissue Tek Sakura, Zoeterwoude, Niederlande
Eosin Merck, Darmstadt
Ethanol 99,8% Carl Roth, Karlsruhe
FACS-Puffer BD, Heidelberg
Material
20
FACS-Clean BD, Heidelberg
Fix & Perm Zellpermeabilisierungskit An der Grub Bio Research, Wien,
Österreich
Fluoprep bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich
Fötales Kälberserum (FCS) Gibco BRL, Eggenstein
Hämalaunlösung nach Mayer Merck, Darmstadt
Heparin-Natrium Ratiopharm, Ulm
Hoechst Nr. 33258, Kernfarbstoff Sigma, Steinheim
LB Broth EZMix™ Sigma, Steinheim
L-Glutamin mit Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Lysepuffer für Durchflusszytometrie
ADG-Lyse An der Grub Bio Research, Wien,
Österreich
Opti-Lyse B Beckman Coulter, Krefeld
Natriumacid (NaN3) Sigma, Deisenhof
Natriumhydroxid Sigma, Steinheim
Paraformaldehyd (PFA) Sigma, Steinheim
PBS PAA Laboratories, Pasching, Österreich
RPMI 1640 (ohne Glutamin) PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Saponin (weiß, rein) Merck, Darmstadt
Schwefelsäure (2N) Carl Roth, Karlsruhe
Streptavidin-Alexa647 Invitrogen Molecular Probes, Karlsruhe
Streptavidin-TRITC Dianova, Hamburg
Tertiäres Amylalkohol Sigma, Steinheim
2,2,2 Tribromethanol Sigma, Steinheim
Trypanblau-Lösung Biochem AG, Berlin
Wasserstoffperoxid (30%) Merck, Darmstadt
Material
21
2.3.2 Medien, Puffer und Lösungen
FACS-Waschpuffer 990 ml PBS
10 ml FCS
0,02 % Natriumacid
LB-Medium 20,6 g LB Broth EZMix™
Ad 1 l A. bidest.
R10F 500 ml RPMI 1640 (ohne Glutamin)
10 % FCS
2 % L-Glutamin (200 nM)
2 % Penicillin-Streptomycin
Saponin-Puffer 500 ml FACS-Waschpuffer
0,5 g Saponin
Trypanblau-Lösung 50 ml Trypanblau-Stammlösung
50 ml PBS
2.3.3 Kits
ApoScreen Annexin-V-PE Kit Southern Biotech, Birmingham, USA
TSA Biotin System NEL 700 NEN Life Science Products, Boston, USA
2.4 Proteinbiochemische Arbeiten
2.4.1 Kits
CBA Mouse Inflammation Kit BD Biosciences, San Diego, USA
Bio-Plex Mouse IL-17 und IL-9 Assay Bio-Rad Laboratories, München
Cytokine Assay Kit
Cytokine Reagent Kit
Diluent Kit
Cytokine Panel mouse IL-9 and IL-17
Material
22
2.5 Antikörper
2.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie
Primärantikörper
Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant
Maus CD25 PE 3C7 Ratte IgG2b, κ Southern Biotech,
Birmingham
Maus CD4 PE RM4-5 Ratte IgG2a, κ BD Biosciences,
Heidelberg
Maus CD4 biotinyliert GK1.5 Ratte IgG2b, κ eBioscience, Hitfield,
UK
Maus CD45 PE-Cy7 I3/2.3 Ratte IgG Beckman Coulter,
Krefeld
Maus CD69 PE H1.2F3 Armenischer Hamster
IgG1, λ
BD Biosciences,
Heidelberg
Maus CTLA-4 unmarkiert UC10-
4F10-11
Armenischer Hamster
IgG1, λ
BD Biosciences,
Heidelberg
Maus F4/80 PE A3-1 Ratte IgG2b, κ Acris Antibodies,
Hiddenhausen
Maus ICOS PE 7E.17G9 Ratte IgG2b, κ eBioscience, Hitfield,
UK
Maus Ly6G PE 1A8 Ratte IgG2a Miltenyi Biotech,
Bergisch Gladbach
Maus Mac3 FITC M3/84 Ratte IgG1, λ BD Biosciences,
Heidelberg
Material
23
Sekundärantikörper
Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant
Hamster IgG biotinyliert G70-204,
G94-56
Maus IgG1, κ und
IgG2b, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
Isotypkontrollen
Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant
TNP unmarkiert A19-3 Hamster IgG1, κ BD Biosciences,
Heidelberg
TNP PE G235-
2356
Armenischer Hamster
IgG1, λ
BD Biosciences,
Heidelberg
TNP PE A95-1 Ratte IgG2b, λ BD Biosciences,
Heidelberg
2.5.2 Antikörper für die Immunfluoreszenzmikroskopie
Primärantikörper
Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant
Maus CTLA-4 unmarkiert UC10-
4F10-11
Armenischer Hamster
IgG1, λ
BD Biosciences,
Heidelberg
Maus CD4 Alexa647 GK1.5 Ratte IgG2b, κ eBioscience, Hatfield,
UK
Maus Foxp3 Alexa488 FJK-16s Ratte IgG2a, κ eBioscience, Hatfield,
UK
Material
24
Sekundärantikörper
Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant
Hamster IgG biotinyliert G70-204,
G94-56
Maus IgG1, κ und
IgG2b, κ
BD Biosciences
Pharmingen,
Heidelberg
Isotypkontrollen
Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant
TNP unmarkiert A19-3 Hamster IgG1, κ
BD Biosciences
Pharmingen,
Heidelberg
Alexa647 Ratte IgG2a eBioscience, Hatfield,
UK
Alexa488 Ratte IgG2a, κ eBioscience, Hatfield,
UK
2.6 Tierexperimentelle Arbeiten
Avertin-Mausnarkose 100% 1 g 2,2,2-Tribrommethanol (Aldrich T4)
1 ml 2-Methyl-2-butanol
Diphtherie-Toxin Merck, Darmstadt
Inhalationsanästhetikum Sevofluran Abbott, Maidenhead, UK
Material
25
2.7 Datenbanken und Software
FlowJo 7.2 Tree Star Inc., Ashland, OR, USA
GraphPad Prism 5.0.1 GraphPad Software Inc., San Diego, CA,
USA
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
MetaMorph Offline 7.1.4.0 Molecular Devices, Downingtown, PA,
USA
Spot Advanced 4.6 Diagnostic Instruments, Sterling Heights,
MI, USA
Methoden
26
3 Methoden
3.1 Tierexperimentelle Methoden
3.1.1 Genehmigungen, Tiere und Tierhaltung
Unter Aktenzeichen LALLF M-V/TSD/7221.3-1.1-037/08 wurden alle durchgeführten
Tierversuche durch das Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt des
Bundeslandes Mecklenburg-Vorpommern entsprechend des deutschen Tierschutzgesetzes vor
Versuchsbeginn genehmigt.
Als Versuchstiere wurden ausschließlich weibliche Mäuse im Alter zwischen 8 bis 12
Wochen und mit einem Gewicht von 20 bis 25 g eingesetzt. Alle Tiere stammten aus der
eigenen Zucht. Sowohl die Haltung als auch die Zucht der Versuchsmäuse erfolgten in
Übereinstimmung mit den Richtlinien des deutschen Tierschutzgesetzes in konventionellen
Tierräumen der Universität Greifswald im Biotechnikum (Walther-Rathenau-Straße 49a,
17489 Greifswald).
3.1.2 Verwendete Mausstämme
Um die Rolle von CD4+Foxp3+ T-Zellen in der Sepsis zu beleuchten, wurde in dieser Arbeit
die transgene DEREG-Mauslinie (depletion of regulatory T cells) verwendet. Diese Tiere sind
auf dem genetischen C57Bl/6-Hintergrund und exprimieren ein Fusionsprotein aus einem
Diphtherie-Toxin-Rezeptor (DTR) und eGFP (enhanced green fluorescent protein), welches
unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus steht [39]. Da in Wildtyp-Mäusen kein funktioneller
Rezeptor für Diphtherie-Toxin (DT) existiert und murine Wildtyp-Zellen deshalb nicht
sensitiv für die Proteinbiosynthese-inhibierende Wirkung von DT sind [93], ist in DEREG-
Mäusen die selektive Depletion von Foxp3-positiven Zellen über eine DT-Applikation in vivo
möglich. Gleichzeitig erlaubt die Expression von eGFP die einfache Visualisierung dieser
Zellen ex vivo über Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. In den Experimenten
und in der Zucht (DEREG x C57Bl/6) wurden ausschließlich heterozygote DEREG-Tiere
verwendet, da Tiere, welche für das DTR-eGFP-Konstrukt homozygot sind, nicht lebensfähig
waren. Als Kontrollen dienten C57Bl/6-Wildtypmäuse.
Methoden
27
3.1.3 Typisierung
Zur Unterscheidung der heterozygoten DEREG-Mäuse von ihren C57Bl/6-Wildtyp-
Wurfgeschwistern wurde allen weiblichen Mäusen der Zucht im Alter zwischen 6 und 8
Wochen durch Retroorbitalpunktion 150 µl Blut entnommen. Alle Blutentnahmen wurden
unter Sevoflurananästhesie durchgeführt. Bis zur weiteren Verwendung wurden die
Vollblutproben mit 50 µl Heparin antikoaguliert und kühl gelagert.
Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden die Proben mit 100 µl eines PE-markierten
anti-CD4-AK (verdünnt 1:500 in FACS-Puffer) für 30 Minuten auf Nasseis in Dunkelheit
inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 200 µl eines Lysepuffers zur
Erythrozytenlyse, der 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur mit der Probe reagierte.
Daraufhin wurde mit 2 ml Aqua bidest. für weitere 15 Minuten inkubiert.
Nach zwei Waschschritten (301,6 × g; 4° C; für 6 Minuten) wurden die Zellpellets in 250 µl
FACS-Waschpuffer resuspendiert und mit dem Durchflusszytometer (FACScan) analysiert.
Proben mit deutlich doppelt-positiven Populationen für CD4 und GFP wurden als von
DEREG-Mäusen stammend gewertet.
3.1.4 Narkose
Zur Narkose der Versuchsmäuse vor chirurgischen Eingriffen wurden 17 µl/g Körpergewicht
einer 2,5 %-igen Avertinlösung intraperitoneal appliziert.
3.1.5 In vivo Depletion von Foxp3+ Tregs
Prophylaktischer Ansatz
Zur prophylaktischen Depletion der CD4+ Foxp3+ Tregs wurde DEREG-Mäusen
48 und 24 Stunden vor Induktion der Sepsis jeweils 1 µg Diphtherie Toxin gelöst in
100 µl PBS intravenös über die laterale Schwanzvene appliziert. Als Kontrollmäuse dienten
DEREG-Tiere, welchen 100µl PBS als Volumenkontrolle intravenös appliziert wurde, und
C57Bl/6-Mäuse, welche ebenfalls 1 µg DT in 100 µl PBS intravenös bekamen. Alle
Lösungen wurden vor der Infusion auf 37° C erwärmt um eine Aktivierung des
Immunsystems zu verhindern.
Verzögerter Depletions-Ansatz
In einem verzögerten Depletions-Ansatz wurde den unterschiedlichen Gruppen jeweils
4 Stunden vor Induktion der Sepsis 1 µg Diphtherie Toxin in 100µl PBS oder die
entsprechende PBS- Volumenkontrolle intravenös über die laterale Schwanzvene appliziert.
Alle Lösungen wurden körperwarm verabreicht.
Methoden
28
3.1.6 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP)
Zur Induktion einer polymikrobiellen Sepsis wurde das CASP-Modell verwendet. Dieses
spiegelt sehr reproduzierbar die klinische Situation einer diffusen Peritonitis und
abdominellen Sepsis infolge einer Nahtinsuffizienz nach chirurgischen Eingriffen wider.
Vor der chirurgischen Intervention wurden die Versuchsmäuse mit einer intraperitonealen
Applikation von 17 µl/ g KG einer 2,5 %-igen Avertinlösung narkotisiert, bevor sie
anschließend fixiert und die Bauchhaut durchtrennt wurde. Nach Eröffnung der
Peritonealhöhle mit einem 1,5 cm langen Schnitt entlang der Linea alba konnte der Übergang
des Ileums ins Caecum aufgesucht werden. Der Darm wurde hier aus der Bauchhöhle
entnommen und 1,5 cm distal der Ileozäkalklappe auf der anti-mesenterialen Seite mit einem
16 Gauge Venenverweilkatheter punktiert und mit 7/0 Ethilon fixiert. Anschließend wurde
der Mandrin entfernt und der Stent 1 mm oberhalb der Serosa abgeschnitten. Zur Überprüfung
von Lage und Durchlässigkeit des Stents wurde eine kleine Menge Fäzes aus dem Darm in
die Bauchhöhle gedrückt bevor der Darm wieder in die Situs gebracht wurde. Zur
Volumensubstitution wurden anschließend 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung appliziert
und die Wundränder von Peritoneum und Bauchhaut mit 4/0 Ethilon vernäht. Schon nach
wenigen Stunden entwickelten die Tiere deutliche Symptome einer systemischen
Entzündung. Soweit nötig dienten Tiere mit gleicher Vorbehandlung aber ohne CASP-
Operation als entsprechende Kontrolltiere.
Alle Operationen wurden von der kooperierenden Chirurgin Dr. med. Katharina Cziupka aus
der Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie des
Universitätsklinikums Greifswald durchgeführt.
3.1.7 Überlebenskinetiken
Das Überleben der Versuchstiere nach Induktion der Sepsis durch CASP-Operation wurde für
72 Stunden in zeitlichen Intervallen von 3 Stunden beobachtet und dokumentiert.
Anschließend wurde für weitere 7 Tage einmal täglich der Zustand der Tiere kontrolliert.
Überlebende Mäuse wurden zur Serumgewinnung 14 Tage nach Induktion der Sepsis mittels
Avertin narkotisiert und über retroorbitale Punktion entblutet, bevor sie schmerzfrei durch
zervikale Dislokation getötet wurden. Über den gesamten Zeitraum war der Untersucher für
die Gruppenzugehörigkeit der einzelnen Mäuse verblindet. Erst nach Abschluss der
Überlebenskinetiken erfolgte die Entblindung.
Methoden
29
3.1.8 Bewertung der Symptomschwere in septischen Tieren
Parallel zu den Überlebenskinetiken wurde in den ersten 72 Stunden nach CASP-Operation
die Schwere der Krankheitssymptome der septischen Tiere erfasst. Dafür wurde der
Allgemeinzustand jedes einzelnen septischen Tieres beobachtet und dokumentiert. Tabelle 2
zeigt die beurteilten Parameter, Bewertungskriterien und die ihnen zugeordnete Score-Werte.
In zeitlichen Intervallen von 3 Stunden wurden die Mäuse nach diesen Parametern bewertet
und für jeden Beobachtungszeitpunkt durch Aufsummierung der Einzelscore-Werte ein
Belastungsscore (0 bis 12 Score-Punkte) ermittelt. Der Untersucher war dabei für die
Gruppenzugehörigkeit der einzelnen Tiere verblindet. Diese Verblindung wurde erst nach
Abschluss des Experiments aufgelöst. Nach dem Beobachtungszeitraum von 3 Tagen hatten
alle Versuchstiere entweder den Ausgangsscore-Wert wieder erreicht oder waren bereits in
der Sepsis gestorben.
Parameter Untersuchung Bewertung Score-Wert
Erscheinungsbild Inspektion - normal, sauber gepflegtes Fell
- gesträubtes Fell
- nasses Fell
- schleimige Augen
0
1
2
3
Atmung Inspektion - normal
- beschleunigt
- schwer
- schwach
0
1
2
3
Spontanverhalten Beobachtung - normal, lebhaft, neugierig
- verlangsamt, sitzende Haltung
- träge, buckelige Haltung,
schwankender Gang
- Seitenlage
0
1
2
3
Provoziertes
Verhalten
Beobachtung - Maus flieht bei Käfigöffnung
- flieht bei Annäherung der
Hand
- flieht erst bei Berührung
- flieht gar nicht
0
1
2
3
Tabelle 2: Bewertungsparameter zur Einschätzung der Schwere der Krankheitssymptome der septischen
Tiere nach CASP-Operation
Methoden
30
3.1.9 Tötung von Versuchstieren
Die Versuchstiere wurden entsprechend den Bestimmungen des Deutschen
Tierschutzgesetzes mit Avertin narkotisiert und durch zervikale Dislokation getötet.
3.1.10 Serumgewinnung und Peritoneallavage
Versuchsmäuse wurden zur Serumgewinnung 20 h nach CASP mittels Avertin narkotisiert
und durch retroorbitale Punktion entblutet. Anschließend erfolgte die Zentrifugation des
gewonnen Vollblutes bei 16060 × g für 10 Minuten. Das gewonnene Serum wurde
abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und einem weiteren
Zentrifugationsschritt zugeführt. Abschließend wurde das Serum erneut in ein neues
Reaktionsgefäß überführt, bei -156° C in flüssigem Stickstoff schockgefroren, und bis zur
weiteren Analyse bei - 80° C gelagert.
Zur Lavage der Peritonealhöhle erfolgte die schmerzfreie Tötung der Tiere 20 h nach
Sepsisinduktion durch zervikale Dislokation und die anschließende Desinfektion der Haut in
70 %-igem Ethanol. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden steril unter der
Sicherheitswerkbank durchgeführt, um bakterielle Kontaminationen zu verhindern.
Anschließend wurde die Bauchhaut mit sterilem Präparationsbesteck unter Vermeidung einer
peritonealen Perforation vom Bauchfell gelöst. Daraufhin erfolgte die Spülung der
Bauchhöhle mit 2 ml eiskaltem PBS, von dem etwa 1,5 ml für anschließende bakteriologische
Untersuchungen und Kryokonservierung zurückgewonnen werden konnten. Danach wurde
die Bauchhöhle erneut mit 5 ml 20 % FCS/PBS lavagiert um peritoneale Zellen zu gewinnen,
welche der durchflusszytometrischen Analyse zugeführt wurden.
3.1.11 Organexplantation
Zur Explantation der Organe wurden Brust- und Peritonealhöhle unter sterilen Bedingungen
chirurgisch eröffnet. Die Milz, die Leber, eine Niere, die beiden Lungenflügel und der
Thymus wurden entnommen, in 2 ml steriles PBS überführt und bis zur weiteren Verwendung
auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Organe samt PBS gewogen und das
Nettoorgangewicht bestimmt.
Des Weiteren wurden der mesenteriale Lymphknoten und 2 bis 3 Peyer’sche Plaques samt
Darmabschnitt entnommen und zur Kryokonservierung in Einbettmedium überführt. Nach
gleichem Vorgehen wurde auch der Thymus und ein Teil der Milz zur Konservierung
vorbereitet, bevor sie zusammen mit den anderen Asservaten in flüssigem Stickstoff
Methoden
31
schockgefroren und anschließend bei – 80° C bis zur histologischen Aufbereitung gelagert
wurden.
3.1.12 Bakteriologische Untersuchungen
Zur Bestimmung der bakteriellen Last in verschiedenen Organen wurden die Gewebe jeweils
in 2 ml steriles PBS überführt und mittels Ultraturax bei 9500 rpm homogenisiert. Die
gewonnen Homogenisate wurden in unterschiedlichen Verdünnungen (Tabelle 3) auf Columbia
Blutagar ausplattiert und für 22 Stunden bei 37° C und 5 Vol.-% CO2 kultiviert. Anschließend
wurde die Zahl der gewachsenen Kolonien bestimmt und auf das Gesamtorgangewicht
bezogen. Jede Verdünnungsstufe wurde dabei als Dreifachbestimmung durchgeführt.
3.2 Zellbiologische Methoden
3.2.1 Isolation muriner Splenozyten
Zur Isolation der murinen Splenozyten wurden die entnommen Milzen durch ein steriles
Zellsieb mit 70 µm Maschenweite gepresst und in 50 ml 20 % FCS/PBS aufgenommen. Nach
einer Zentrifugation (301,6 × g, 4° C, 6 Minuten) wurde das Zellpellet zur Erythrozytenlyse in
5 ml Aqua bidest. resuspendiert, anschließend die Suspension mit 20 % FCS/PBS auf 50 ml
aufgefüllt und erneut zentrifugiert.
Danach konnte der Überstand verworfen und das Pellet in 5 ml 20 %/PBS zur weiteren
Analyse aufgenommen werden.
Organ Eingesetztes Volumen
pro Platte
Verdünnungsstufen
Blut, Niere, Lunge 10 µl Unverdünnt ; 1:10; 1:100
Lavage, Leber 10 µl 1:10; 1:100; 1:1000
Milz 100 µl Unverdünnt ; 1:10; 1:100
Tabelle 3: eingesetzte Verdünnungsstufen zur Bestimmung der bakteriellen Last in verschieden Organen
nach CASP
Methoden
32
3.2.2 Zellzahlbestimmungen und Vitalitätsprüfung
Zellzahlbestimmungen wurden mittels Trypanblau-Färbung durchgeführt. Dafür wurden 10 µl
der Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau-Lösung gemischt. Anschließend wurde
lichtmikroskopisch die Zellzahl in 10 µl dieses Gemisches mittels Bürker-Kammer ermittelt
und über Verdünnungsfaktor und Kammerfaktor die Gesamtzellzahl der Ausgangsuspension
bestimmt.
Da der blaue Farbstoff nur in tote Zellen eindringen kann, war gleichzeitig eine
Unterscheidung zwischen vitalen (hellen) und toten (blauen) Zellen möglich.
3.2.3 Färbungen für die durchflusszytometrischen Analysen
Färbung muriner Splenozyten
Zur phänotypschen Charakterisierung der murinen Splenozyten anhand bestimmter
Aktivierungsmarker und Oberflächenantigene wurde die Durchflusszytometrie genutzt. Zur
Färbung membranständig-extrazellulärer Strukturen wurde die Zellzahl pro FACS-Röhrchen
auf 1×106 eingestellt und die Zellsuspension mit 50 µl der in FACS-Waschpuffer verdünnten
Antikörperlösung (Antikörperverdünnungen siehe Tabelle 4) bzw. der Isotypkontrollen in
entsprechender Konzentration inkubiert (30 Minuten, auf Eis). Anschließend wurde die
Antikörperlösung durch zweimalige Zentrifugation heruntergewaschen (301,6 × g, 4° C,
6 Minuten) und die Zellen mit 50 µl des Sekundärantikörpers, verdünnt in FACS-
Waschpuffer, inkubiert. Nach zwei abschließenden Waschschritten wurde das Zellpellet in
250 µl FACS-Puffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometer analysiert.
Zur Färbung des intrazellulären CTLA-4-Moleküls schloss sich an die Inkubation mit dem
anti-CD4-PE-Antikörper eine sofortige Inkubation mit 50 µl der Reagenz A des Fix & Perm-
Kits an. Anschließend wurden die Proben einmal mit Saponin-Puffer gewaschen (301,6 × g,
4° C, 6 Minuten) und dann mit 100 µl des anti-CTLA-4-Antikörpers, verdünnt in Reagenz B
des Kits, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann einmal mit Saponin-Puffer
gewaschen und daraufhin mit dem sekundären anti-Hamster-IgG-Antikörper inkubiert, bevor
nach zwei weiteren Waschschritten mit 50 µl Streptavidin-Alexa-647, verdünnt in Saponin-
Puffer, inkubiert wurde. Vor der Analyse am Durchflusszytometer wurden die Proben
abschließend einmal mit Saponin-Puffer gewaschen und in 250 µl FACS-Puffer
aufgenommen.
Alle Inkubationsschritte wurden bei 4°C im Dunkeln für 30 Minuten und
Zentrifugationsschritte mit 301,6× g bei 4° C für 6 Minuten durchgeführt. Die abschließende
Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mit der FlowJo-Analysesoftware.
Methoden
33
Färbung peritonealer Zellen
Zur Isolation der Zellen aus der Peritoneallavage wurde diese in 10 ml 20 % FCS/PBS
aufgenommen und zweimal bei 301,6 × g für 6 Minuten bei 4° C gewaschen. Anschließend
wurde die Färbung von Makrophagen (F4/80+ bzw. Mac3+), neutrophilen Granulozyten
(Ly6G+) und CD4+ T-Zellen analog zur Färbung muriner Splenozyten durchgeführt. Für die
eingesetzte Antikörperkonzentration siehe Tabelle 5
Färbung von Vollblutproben
Färbungen zur durchflusszytometrischen Analyse von Vollblut-Proben wurden analog zum
Typisierungsprotokoll (siehe 3.1.2) durchgeführt
Antikörper Ausgangskonzentration Eingesetzte Verdünnung
aCD69-PE 0,2 mg/ml 1:100
aCD25-PE 0,1 mg/ml 1:50
aICOS-PE 0,2 mg/ml 1:50
aCD4-PE 0,2 mg/ml 1:500
aCD4-biotinyliert 0,5 mg/ml 1:100
aCD45-PECy7 0,1 mg/ml 1:500
aCTLA-4-unmarkiert 0,5 mg/ml 1:25
aHamster-IgG-biotinyliert 0,5 mg/ml 1:50
Streptavidin-Alexa647 1:800
Tabelle 4: eingesetzte Antikörperverdünnungen zur durchflusszytometrischen Analyse muriner Splenozyten
Antikörper Ausgangskonzentration Eingesetzte Verdünnung
aCD4-biotinyliert 0,5 mg/ml 1:100
aMac-3-FITC 0,5 mg/ml 1:100
aF4/80-PE 1:100
aLy6G-PE 5,5 µg/ml 1:50
Streptavidin-Alexa647 1:800
Tabelle 5: eingesetzte Antikörperverdünnungen
Methoden
34
3.3 Histologische Methoden
3.3.1 Herstellung von Kryostatschnitten
Kryostatschnitte der Milzen für histologische Analysen wurden in 6 µm Dicke mit Hilfe des
Microtom-Kryostats angefertigt. Nach Trocknung der Schnitte über Nacht wurden die
Objekte für 5 Minuten in Aceton fixiert, getrocknet und anschließend bei – 80° C bis zur
weiteren Bearbeitung gelagert.
3.3.2 Immunfluoreszenzmikroskopische Dreifachfärbung von CD4/Foxp3/CTLA-4
Zur Darstellung von CD4, Foxp3 und CTLA-4 in Kryostatschnitten muriner Milzen wurden
die Objekte auf Raumtemperatur gebracht und anschließend mit 20 µl 20 % FCS/PBS für
10 Minuten inkubiert um unspezifische Bindungen zu verhindern und den Schnitt zu
rehydratisieren. Wie alle weiteren Reaktionsschritte auch erfolgte diese Inkubation bei
Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Anschließend erfolgte die sequentielle
Behandlung der Kryostatschnitte mit 50 µl einer 1,5 %-igen H2O2-Lösung zur Inaktivierung
endogener Peroxidasen und mit einem Biotin-Blocking-System entsprechend den Angaben
des Herstellers zur Blockung endogenen Biotins. Zwischen allen Schritten wurde jeweils
zweimal für 4 Minuten in PBS gewaschen.
Folgend wurden die Objekte mit 75 µl des Hamster-anti-Maus CTLA-4-Antikörpers (1:250 in
20 % FCS/PBS) bzw. der entsprechenden Isotypkontrolle über Nacht bei 4° C inkubiert. Nach
zweimaligem Waschen erfolgte die Zugabe des zweiten Antikörpergemisches bestehend aus
biotinyliertem anti-Hamster-IgG (1:100), Alexa-647 konjugiertem anti-Maus-CD4 (1:50) und
Alexa-488 gekoppelten anti-Maus-Foxp3 (1:100) bzw. den entsprechenden Isotypkontrollen
und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Die Verdünnung aller Antikörper
erfolgte in 20 % FCS/PBS.
Nach zwei Waschschritten in PBS wurden die Proben für 30 Minuten mit 50 µl Streptavidin-
POD (1:500 in PBS) inkubiert. Anschließend wurde zweimal gewaschen und für 3 Minuten
mit 50 µl Biotinyltyramid (1:200 in Amplifikationsdiluenten des TSA-Kits) erneut inkubiert.
Danach erfolgte nach zwei weiteren Waschschritten die 60-minütige Inkubation mit 50 µl
Streptavidin-TRITC (1:100 in 20 % FCS/PBS), bevor nach Waschen in PBS mit Fluoprep
eingedeckelt wurde.
Die Begutachtung der Schnitte erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop von Zeiss, mit dem
eine Aufnahme von digitalen Fotos zur späteren Auswertung mit der Metamorph-Software
möglich war.
Methoden
35
3.4 Proteinbiochemische Methoden
3.4.1 Bestimmung der Zytokinkonzentrationen in Serum und Lavage
Zur Bestimmung der Konzentrationen der Zytokine IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF und
IL-12p70 in Serum und Lavage wurde ein kommerziell erhältliches CBA-Maus-
Inflammations-Kit verwendet. Diese Technik erlaubt es mehrere Zytokine in einer relativ
kleinen Probenmenge zu messen. Zur Optimierung der Messprozedur wurden die Angaben
des Herstellers in leicht abgewandelter Form befolgt. Dafür wurden jeweils 20 μl der zu
untersuchenden Probe mit 20 μl des PE-Detektions-Reagenzes und 20 μl eines Gemisches der
sechs Fang-Beads (jeweils 1/6 von jedem spezifischen Fang-Bead) für 3 Stunden zusammen
bei Raumtemperatur in einer 96-Lochboden-Platte inkubiert. Anschließend wurden die
Proben mit 200 μl des Waschpuffers für 4 Minuten mit 250 x g zentrifugiert, der Überstand
abgekippt und in 200 μl des Waschpuffers resuspendiert. Die Proben wurden daraufhin
mittels des Durchflusszytometers gemessen und mit der entsprechenden Software des
Herstellers zur Ermittlung von Absolutkonzentrationen ausgewertet.
3.4.2 Luminexmessung zur Bestimmung der Serumkonzentrationen von IL-9 und
IL-17
Zur quantitativen Bestimmung der Zytokinkonzentrationen von IL-9 und IL-17 im Serum
wurde ein kommerziell erhältliches Kit zur Auswertung mit dem Luminexsystem eingesetzt.
Diese Technologie erlaubt eine gleichzeitige und sehr sensitive Messung verschiedener
Zytokine in einem begrenzten Probenvolumen und einem weiten dynamischen Messrahmen.
Die Probenvorbereitung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Zu einem kurzen Abriss
des Vorgehens: Nach Rekonstitution der Zytokinstandards in entsprechendem Standard-
Diluenten wurde dieser für 30 Minuten auf Eis inkubiert, bevor zur Herstellung von
Standardkurven eine serielle Verdünnung vorgenommen wurde. Anschließend wurden die
Anti-Zytokin konjugierten Beads verdünnt und eine 96-Lochbodenfilterplatte mittels
Vakuumfiltration vorbereitet, bevor 50 µl der Beadlösung in jede Vertiefung gegeben wurde.
Nachdem der Puffer entfernt und die Platte mit Waschpuffer gewaschen wurde, erfolgte die
Zugabe der entsprechend verdünnten Standard- bzw. Probenlösung, welche für 30 Minuten
bei Raumtemperatur auf einer Rüttelplatte in Dunkelheit inkubierten. Anschließend wurde der
Puffer durch Vakuumfiltration entfernt, die Platte gewaschen, 25 µl der
Detektionsantikörperlösung zugegeben und unter gleichen Bedingungen für 30 Minuten
inkubiert. Nach mehreren Waschschritten erfolgte jeweils die Zugabe von 50 µl Streptavidin-
PE-Lösung in entsprechender Verdünnung, welche ebenfalls 30 Minuten inkubierte.
Methoden
36
Abschließend wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer gewaschen und die Beads in 100 µl
Assay-Puffer resuspendiert. Die Messung der Proben wurde nach Anleitung des Herstellers
am Luminexsystem vorgenommen.
3.5 Statistische Auswertung
Zur statistischen Testung der im Ergebnisteil gezeigten Daten auf signifikante Unterschiede
wurde der nicht-parametrische zweiseitige Mann-Whitney-U Test verwendet.
Abweichend davon wurde die statistische Auswertung der vergleichenden
Überlebenskinetiken mit Hilfe der Kaplan-Meier-Überlebenskurven und dem log rank Test
durchgeführt.
Soweit nicht anders angegeben, sind alle im Ergebnisteil gezeigten Daten als Mediane der
entsprechenden Gruppen dargestellt.
Statistisch signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 wurden mit
einem * gekennzeichnet. War p < 0,01 wurden Unterschiede als hoch signifikant gewertet und
mit ** verdeutlicht. Höchst signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,001 wurden
mit *** gekennzeichnet.
Ergebnisse
37
4 Ergebnisse
4.1 Experimentelle Vorarbeiten
4.1.1 Prophylaktische Depletion von Tregs in vivo
Im Vorfeld der Experimente zur Rolle der Tregs in der Sepsis musste ein sicheres
Applikationsschema von Diphtherie-Toxin (DT) zur Depletion der Tregs etabliert werden.
Dabei stand besonders die Vermeidung einer peritonealen Reizung vor Induktion der Sepsis
im Vordergrund. Da die Peritonealhöhle den Fokus in unserem Sepsismodell CASP darstellt,
schien die bisher publizierte intraperitoneale Gabe von DT dafür ungeeignet [39]. Um
auszuschließen, dass residuale Abwehrzellen im Vorfeld der CASP durch DT aktiviert oder
andere innate Immunzellen ins Peritoneum rekrutiert werden, wurde deshalb ein intravenöses
Applikationsschema gewählt.
DEREG-Mäuse, die ein eGFP-DTR- (Diphtherie-Toxin-Rezeptor) Fusionsprotein unter der
Kontrolle des Foxp3-Lokus exprimieren, erhielten zur Depletion ihrer Foxp3+ Tregs 1 µg DT
gelöst in einem Volumen von 100 µl sterilem PBS an zwei Zeitpunkten (t1= - 48 h und
t2= - 24 h) über die laterale Schwanzvene. Die Effizienz der Depletion wurde mit einer
durchflusszytometrischen Analyse des Vollblutes und der Splenozyten, sowie der
fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der Thymi gesichert. Zum Zeitpunkt t3= 0 h
konnten in keinem der untersuchten Gewebe und Körperflüssigkeiten CD4+Foxp3+ Tregs
nachgewiesen werden (Abbildung 3).
Die applizierte Dosis DT war für die Tiere nicht toxisch. Zu keinem Zeitpunkt im Verlauf der
gesamten Experimente waren DEREG-Mäuse oder C57Bl/6-Wildtypkontrollen durch die
Verabreichung von DT per se in ihrem allgemeinen Erscheinungsbild oder ihrem normalen
Verhalten beeinträchtigt.
Ergebnisse
38
4.1.2 Ansatz zur verzögerten Depletion von Tregs
Die Immunantwort in der Sepsis verläuft biphasisch [94] (siehe 1.1.4). Nach einer
hyperinflammatorischen Immunantwort mit hohen Konzentrationen der pro-
inflammatorischen Zytokine TNF-, IL-1 und IL-6 kommt es zu einer kompensatorischen
anti-inflammatorischen Immunantwort mit steigenden Serumspiegeln von IL-10 und TGF-.
Um diesen dynamischen Prozessen in der systemischen Entzündungsreaktion Rechnung zu
tragen, sollte neben der prophylaktischen Depletion auch ein Modell zur verzögerten
Depletion der Tregs etabliert werden. Unter der Hypothese, dass regulatorische T-Zellen in
der sehr frühen Hyperinflammation für eine Begrenzung einer überschießenden
Immunantwort wichtig sind, später aber in die Immunparalyse führen, sollte der Einfluss
einer verzögerten Depletion auf den Verlauf der Sepsis untersucht werden.
Abbildung 3: Vollständige Depletion der CD4+ Foxp3+ regulatorischen T-Zellen nach
zweimaliger i.v. Applikation von Diphtherie-Toxin (DT)
DEREG-Mäusen im Alter von 10 Wochen wurde zu den Zeitpunkten t1= -48 h und t2= -24 h jeweils
1 µg DT i.v. appliziert. Zum Zeitpunkt t3= 0 h wurden Blut, Milz und Thymus gewonnen. Vollblut und
murine Splenozyten wurden mit aCD4-PE bzw. biotinyliertem aCD4 und Streptavidin-Alexa-647
angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (linke Spalte und Mitte). Kryostatschnitte des Thymus
wurden mit aFoxp3-Alexa488 (grün) und aCD4-Alexa647 (blau) gefärbt und
fluoreszenzmikroskopisch untersucht (rechte Spalte). Als Kontrolle dienten mit sterilem PBS
behandelte DEREG-Mäuse. 24 h nach der letzten DT-Applikation waren nahezu keine CD4+Foxp3+
Zellen (weiße Pfeile) mehr nachweisbar. n = 2 Tiere/ Gruppe; Ergebnisse eines Tieres exemplarisch
gezeigt
Ergebnisse
39
Zur Aufklärug der Rolle der Tregs in solch einem verzögerten Interventionsansatz in der
CASP musste geprüft werden, ob und in welcher Kinetik durch eine einmalige intravenöse
Applikation von DT eine hinreichende Treg-Depletion erreicht werden kann. Dazu wurden
DEREG-Mäuse wie oben genannt mit 1 µg DT behandelt. Zu definierten Zeitpunkten wurden
dann Splenozyten isoliert und das Ausmaß der Treg-Depletion verfolgt.
Die durchflusszytometrischen Analysen (Abbildung 4) zeigten, dass eine einmalige intravenöse
Gabe von DT innerhalb der ersten 24 h nach Applikation zu einer kontinuierlichen Abnahme
und schließlich zu einer nahezu vollständigen Depletion der CD4+Foxp3+ Treg-Population
führte.
Ausgehend von diesen Daten wurde für die weiteren Experimente zur verzögerten Depletion
der Tregs ein Applikationzeitpunkt t-1= -4 h vor Induktion der Sepsis gewählt. Zum Zeitpunkt
t0 der CASP-Operation ist nach diesem Schema der prozentuale Anteil der Foxp3-positiven
Tregs sowohl an den Gesamtlymphozyten als auch an CD4-positiven T-Zellen noch fast
unverändert. Damit konnte erreicht werden, dass die Tregs in der frühen Phase der
Hyperinflammation der Sepsis noch im System sind, im weiteren Verlauf aber kontinuierlich
abfallen und 20 h nach CASP vollständig verschwunden sind.
Abbildung 4: Eine einmalige i.v. Applikation von Diphtherietoxin führt in den ersten 24 h zur
kontinuierlichen Abnahme der Treg-Population
DEREG-Mäusen wurde zum Zeitpunkt t0=0 h jeweils 1 µg DT i.v. über die laterale Schwanzvene
appliziert. Nach unterschiedlichen Zeiten (t1= +4 h, t2= +12 h, t3= +16 h oder t4= +24 h) wurden die
Milzen gewonnen und die Splenozyten isoliert. Diese wurden mit einem aCD4-PE Antikörper gefärbt
und durchflusszytometrisch die Abnahme der CD4+Foxp3+ Treg-Population an den Gesamtlymphozyten
analysiert. Dargestellt sind jeweils die Dot-Plots (FL1: Foxp3-GFP gegen FL2: CD4-PE) im
Lymphozytengate; n = 1 Maus/ Zeitpunkt
Ergebnisse
40
4.1.3 Einfluss von Diphtherietoxin auf das bakterielle Wachstum
Obwohl beschrieben ist, dass das vom Corynebacterium diphtheriae gebildete Diphtherie-
Toxin nur die eukaryotische Proteinbiosynthese durch ADP-Ribosylierung des
Elongationsfaktors eEF-2 inhibiert [95], sollte eine Interferenz mit dem bakteriellen
Wachstum der in unserem Sepsismodell bedeutsamen Mikroorganismen ausgeschlossen
werden. Exemplarisch wurde dies bei Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli
(E. coli) und Proteus geprüft. Der Zusatz von 1 µg/ml Diphtherie-Toxin zum Medium
veränderte das bakterielle Wachstum nicht (Daten nicht gezeigt).
4.2 Größe und Aktivierungsstatus der Foxp3+ Treg-Population in der CASP
Im Folgenden sollte der Einfluss einer polymikrobiellen Sepsis auf den Anteil der Foxp3-
positiven Tregs am Pool der CD4-Lymphozyten sowie auf deren Aktivierungsstatus
untersucht werden. Als murines Sepsismodell diente dabei die Colon ascendens Stent
Peritonitis (CASP), welche die klinische Situation einer diffusen Peritonitis nach
chirurgischer Nahtinsuffizienz widerspiegelt.
Um zu untersuchen, wie Tregs auf die generalisierte Infektion in diesem Modell reagieren,
wurden weibliche DEREG-Mäuse einer CASP-Operation unterzogen. 20 Stunden nach
Sepsisinduktion wurden die Milzen dieser Tiere entnommen und durchflusszytometrisch die
Expression von Foxp3 und von verschiedenen Aktivierungsmarkern in der Population der
CD4-positiven T-Lymphozyten bestimmt. Alle Versuchstiere erhielten dabei 48 und
24 Stunden vor CASP intravenös steriles PBS um eine Vergleichbarkeit mit der DT-
Behandlung in den folgenden Experimenten gewährleisten zu können.
Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollmäusen hatte sich der prozentuale Anteil von
CD4+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen an den CD4-positiven Splenozyten nach CASP
verdoppelt (Mediane: 7,9 % vs. 13,9 %; P < 0,01; Abbildung 5A). Dieses zugunsten der Tregs
verschobene Verhältnis von CD4+Foxp3+ Tregs zu CD4+Foxp3- Effektor-T-Lymphozyten
kann wahrscheinlich nicht ausschließlich durch eine periphere Konversion von
konventionellen T-Zellen zu induzierten Tregs erklärt werden. So stieg die auf die
Gesamtmilz bezogene Absolutzellzahl von Tregs nach der CASP (Unbehandelt vs. CASP:
1,1 x 106 vs. 1,7 x 106; P > 0,05) in geringerem Maße an als ihr prozentualer Anteil an der
Ergebnisse
41
CD4-Gesamtpopulation. Dies spricht für einen verstärkten Zelltod von Effektorzellen bei
gleichzeitiger relativer Apoptose-Resistenz von Tregs.
Des Weiteren hatten CD4+Foxp3+ Tregs bereits 20 h nach CASP im Vergleich zu nicht-
septischen Tieren die Aktivierungsmarker CD69 (Unbehandelt vs. CASP: 8,3 % vs. 25,5 %;
P < 0,01; Abbildung 5B), CTLA-4 (23,9 % vs. 65,1 %; P < 0,01; Abbildung 5C) und ICOS
(26,3 % vs. 38,2 %; P = 0,052; Abbildung 5D) stark hochreguliert.
Im Rahmen der polymikrobiellen Sepsis zeigt diese rasche Hochregulation von
Effektormolekülen auf Tregs in der Milz, dass diese Zellpopulation schnell in die
generalisierte immunologische Abwehrreaktion des Wirts einbezogen wird.
Abbildung 5: CASP führte zu einer raschen Aktivierung von CD4+Foxp3+ Tregs und zu
einem erhöhten prozentualen Anteil dieser T-Zell-Subpopulation
Weibliche PBS-vorbehandelte DEREG-Mäuse (PBS an t= -48 h und -24 h) wurden einer CASP-
OP unterzogen. 20 h später wurden die Milzen entnommen und der prozentuale Anteil der Foxp3-
positiven Zellen an den CD4+ T-Lymphozyten ermittelt (A). Zusätzlich wurde die Expression der
Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4 und ICOS auf Tregs (CD4+Foxp3+) bestimmt (B-D). Als
Kontrolle dienten DEREGs, die nach zweimaliger PBS-Applikation unbehandelt gelassen wurden.
Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe; n = 5-6 Tiere /Gruppe; **: P< 0,01.
Ergebnisse
42
4.3 Einfluss der Foxp3+ Tregs auf den Schweregrad der polymikrobiellen Sepsis
4.3.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell.
Da Foxp3+ Tregs in der Sepsis stark aktiviert wurden, stellte sich die Frage, welchen Einfluss
diese Zellen auf die Schwere des Symptomverlaufs und auf das Gesamtüberleben haben. Um
diese Frage zu beantworten, wurden DEREG-Mäuse prophylaktisch 48 und 24 h vor CASP
mit Diphtherie-Toxin vorbehandelt, um regulatorische T-Zellen selektiv zu depletieren. Durch
die Erhebung eines Belastungsscores, der sich aus den Einzelparametern: (1.) allgemeines
Erscheinungsbild, (2.) Atemfrequenz, (3.) spontanes und (4.) provoziertes Verhalten
zusammensetzte, zeigte sich, dass die Treg-Depletion insbesondere in den ersten 36 Stunden
nach Induktion der Sepsis die Krankheitssymptomatik verstärkte (Abbildung 6A). Dennoch
hatte die Depletion der regulatorischen T-Lymphozyten in diesem Modell keinen Einfluss auf
das Überleben der DEREG-Mäuse im Vergleich zu DT-behandelten C57Bl/6-Kontrolltieren
(40 % vs. 50 %; P > 0,05; Abbildung 6B).
Abbildung 6: Eine prophylaktische Treg-Depletion führte zu einer Verschlimmerung des
Krankheitsverlaufs aber nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP
DEREG- und C57Bl/6-Mäuse wurden mit DT (1 µg DT in 100 µl PBS an Tag -1 und -2) vorbehandelt
und anschließend einer CASP-OP unterzogen. Die Schwere der Krankheitssymptome wurde über einen
Belastungsscore erhoben (A) und das Überleben (B) über 3 Tage beobachtet. Der Untersucher war dabei
für die Gruppenzugehörigkeit verblindet. Dargestellt sind die Mediane und Interquartilabstände für
jeden Zeitpunkt (A) und die Kaplan Meier-Überlebenskurven (B); n = 10 Tiere/ Gruppe
Ergebnisse
43
4.3.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion
Um zu untersuchen, ob eine verzögerte Depletion der Tregs den beobachteten
Krankheitsverlauf bei CASP mildern oder das Gesamtüberleben positiv beeinflussen kann,
wurden DEREG-Mäuse 4 h vor CASP-induzierter Sepsis mit DT behandelt.
Dabei zeigten die Belastungsscores trotz erheblicher interindividueller Streuung ähnliche
Ergebnisse wie in der frühen Depletion beobachtet. Auch hier waren die Symptome
insbesondere in den ersten Stunden der Sepsis stärker ausgeprägt, jedoch in geringerem Maß
als bei früher Treg-Depletion (Abbildung 7A).
Die Überlebenskinetiken zeigten in diesem Ansatz ebenfalls keine signifikanten Unterschiede.
Anzumerken ist allerdings, dass die bei einer 16 G-CASP erwartete Überlebensrate von etwa
20-30 % hier mit 70 % vs. 80 % (DEREG-DT vs. C57Bl/6-DT) deutlich höher lag als normal
(Abbildung 7B). Eine Ursache dafür konnte nicht eruiert werden.
Abbildung 7: Die verzögerte Treg-Depletion führt zu einem erschwerten Symptomverlauf, aber
nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP
DEREG- und C57Bl/6-Mäuse wurden 4 h vor der Induktion der Sepsis mit 1 µg DT vorbehandelt. Der
Belastungsscore (A) und das Überleben in Zeitintervallen von 3 Stunden überwacht (B). Bei allen
Beobachtungen war der Untersucher für die Gruppenzugehörigkeit verblindet. Dargestellt sind die
Mediane und Interquartilabstände für jeden Zeitpunkt des Belastungsscores (A) und die Kaplan-Meier-
Überlebenskurven (B); n = 10 Tiere/ Gruppe
Ergebnisse
44
4.4 Einfluss der Foxp3+ Tregs auf die bakterielle Clearance und den Influx von
innaten Immunzellen ins Peritoneum nach CASP
In vorangegangenen Arbeiten aus unserem Labor (Mandy Busse, Christian Pötschke) konnte
gezeigt werden, dass eine Antikörper-vermittelte Depletion aller CD4-positiven Zellen vor
der CASP nicht nur das Überleben günstig beeinflusst, sondern auch durch eine Verstärkung
der lokalen Immunantwort eine systemische Streuung der endogenen Darmbakterien
eindämmt [28]. Des Weiteren konnten durch diese lokal umschriebene Entfesselung der
immunologischen Abwehrreaktion das Ausmaß der Hyperinflammation und des initalen
Zytokinsturms deutlich begrenzt werden.
4.4.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell
Um den Beitrag der Foxp3+ Tregs zu diesem in der CD4-Depletion beobachteten Effekt auf
die Stärke der lokalen Abwehrreaktion in der CASP hin zu klären, wurde im Folgenden das
Peritoneum als primärer Infektionsfokus in unserem Sepsismodell genauer untersucht. Dafür
wurden (1.) die bakterielle Last im Peritoneum, (2.) die von hier ausgehende systemische
bakterielle Streuung und (3.) der Influx von innaten Immunzellen genauer analysiert.
Prophylaktisch Treg-depletierte Mäuse wurden dafür einer CASP unterzogen und die
bakterielle Last in verschiedenen Körperflüssigkeiten und Organen (Blut, Peritoneallavage,
Leber, Lunge, Niere, Milz) 20 h nach Induktion der Sepsis im Vergleich zu nicht-depletierten
Kontroll-Tieren bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Treg-Depletion weder einen
signifikanten Einfluss auf die lokale Bakterienzahl in der Peritonealhöhle (DEREG-DT vs.
DEREG-PBS vs. C57Bl/6: 0,2 x 106/ml vs. 0,86 x 106/ml vs. 2,7 x 106/ml; P > 0,05), noch auf
das Ausmaß der systemischen bakteriellen Streuung hatte (Abbildung 8). Während in
unbehandelten Tieren sterile Bedingungen vorgefunden wurden, zeigten septische Tiere
unabhängig von der Anwesenheit von Tregs regelmäßig hohe bakterielle Lasten im Blut und
allen untersuchten Geweben. Diese Daten sprechen für eine rasche hämatogene Streuung der
Bakterien, deren lokale Eindämmung durch Clearance-Mechanismen des Wirts durch Tregs
anscheinend nicht beeinflusst wird.
Ergebnisse
45
Abbildung 8: Treg-Depletion hat keinen Einfluss auf die systemische bakterielle Streuung in der
CASP
Blut, Peritoneallavage-Flüssigkeit, Leber, Lunge, Niere und Milz wurden 20 h nach Induktion der CASP
von DT-vorbehandelten DEREG-Mäusen gewonnen. Als Kontrollen dienten entweder PBS-
vorbehandelte DEREGs oder DT-vorbehandelte C57Bl/6-Tiere. Die Flüssigkeiten und Gewebs-
homogenisate wurden für 22 h bei 37° C auf Columbia Blut-Agar-Platten inkubiert und anschließend die
Zahl der Kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) auf das Organgewicht bezogen. Die Treg-Depletion hatte
weder Einfluss auf die lokale Clearance noch auf die systemische bakterielle Streuung. Gezeigt sind die
Mediane jeder Gruppe; n = 6 Tiere/ Gruppe
Als erste Abwehrfront des Organismus sind innate Immunzellen am Fokus der Infektion für
die Eindämmung der bakteriellen Streuung unerlässlich. Besonders neutrophile Granulozyten
(Ly6G+) migrierten sehr schnell nach Sepsisinduktion ins Peritoneum, um die eindringenden
Mikroorganismen zu bekämpfen und abzuräumen (DEREG-DT vs. DEREG-PBS vs.
C57Bl/6-DT: 68 % vs. 67 % vs. 51 % des zellulären Infiltrates; Abbildung 9B). Die Gesamtzahl
der peritonealen Makrophagen (F4/80+) dagegen blieb im Sepsisverlauf nahezu unverändert,
was in Anbetracht des massiven Neutrophilen-Influxes zu einem Abfall ihres prozentualen
Anteils am zellulären Gesamtinfiltrat führte (Abbildung 9C).
Ergebnisse
46
In Übereinstimmung mit den bakteriologischen Daten blieb auch die lokale Abwehrreaktion
des angeborenen Immunsystems im Peritoneum durch die Treg-Depletion unbeeinflusst.
Weder die Gesamtzahl der innaten Immunzellen, die im Verlauf der Sepsis ins Peritoneum
wanderten (DT-vorbehandelte DEREGs: 0,9 x 106/ml; PBS- vorbehandelte DEREGs:
1,3 x 106/ml; DT-vorbehandelte C57Bl/6: 1,2 x 106/ml; P > 0,05; Abbildung 9A), noch die
zelluläre Zusammensetzung des Influxes aus Makrophagen und neutrophilen Granulozyten
wurden durch die Depletion der Foxp3+ Tregs signifikant verändert (Abbildung 9B,C).
Abbildung 9: Sowohl Gesamtzahl als auch Zusammensetzung der im Verlauf der CASP ins
Peritoneum wandernden Zellen ist durch die prophylaktische Treg-Depletion unbeeinflusst
20 h nach CASP wurden durch Peritoneallavage mit 5 ml PBS, welches 10 % fötales Kälberserum
enthielt, Zellen aus der Peritonealhöhle von DT-behandelten DEREGs, PBS-behandelten DEREGs und
DT-behandelten C57Bl/6-Mäusen gewonnen. Unbehandelte Tiere dienten als Kontrolle. Die Gesamtzahl
der erhaltenen Zellen wurde bestimmt und auf das Volumen der zurückgewonnenen Lavage-Flüssigkeit
bezogen (A). Anschließend wurde durchflusszytometrisch der Anteil der Makrophagen (F4/80+) und
Neutrophilen (Ly6G+) bestimmt (B,C).
Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe; n = 5-6 Tiere/ Gruppe
Ergebnisse
47
4.4.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion
Im Folgenden sollte untersucht werden, wie sich in der CASP die lokale Immunantwort im
Peritoneum ändert, wenn die Population der Tregs in der Phase der Proinflammation erst
sukzessive kleiner wird. Auch in diesem Depletionsansatz zeigten sich hohe bakterielle
Lasten in allen untersuchten Geweben und Körperflüssigkeiten von verzögert Treg-
depletierten DEREG-Mäusen (Milz 0,1 x 106 CFU/g; Leber: 0,06 x 106 CFU/g; Lunge
0,13 x 106 CFU/g; Niere: 0,02 x 106 CFU/g) (Abbildung 10). Signifikante Unterschiede im
Vergleich zu den verschiedenen Kontrollgruppen konnten jedoch auch hier nicht beobachtet
werden. Insgesamt konnte damit auch durch die verzögerte Treg-Depletion kein
nennenswerter Einfluss auf die bakterielle Clearance in der CASP erreicht werden.
Abbildung 10: Die verzögerte Depletion der Tregs hat keinen Einfluss auf das Ausmaß der
bakteriellen Streuung in der CASP
20 h nach Induktion einer polymikrobiellen Sepsis durch CASP wurden Blut, Peritoneallavage-Flüssigkeit,
Leber, Lunge, Niere und Milz von verzögert DT-behandelten DEREG-Mäusen entnommen. Als Kontrollen
dienten PBS-vorbehandelte DEREG- und DT-vorbehandelte C57Bl/6-Mäuse. Die Flüssigkeiten und
Gewebshomogenisate wurden für 22 h bei 37° C auf Columbia Blutagar-Platten inkubiert. Anschließend
wurde die Zahl der Kolonie-formenden Einheiten (CFUs) bestimmt und die bakterielle Last auf das
Organgewicht bezogen. Die verzögerte Treg-Depletion hatte keinen Einfluss auf lokale bakterielle
Clearance oder bakterielle Streuung. Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe, n = 6 Tiere/Gruppe
Ergebnisse
48
Auch in diesem Ansatz blieben Gesamtzahl des peritonealen Zellinfiltrates (DEREG-DT vs.
DEREG-PBS vs. C57Bl/6-DT: 1,9 x 106/ml vs. 1,7 x 106/ml vs. 1,5 x 106; Abbildung 11A) und
dessen Zusammensetzung unverändert (LyG6+ Neutrophile: 58,4 % vs. 62,8 % vs. 58,5 %;
Abbildung 11C). Auffällig ist jedoch, dass der Gesamtinflux im Vergleich zu den
prophylaktischen Depletionsexperimenten deutlich größer. Eine Ursache hierfür konnte nicht
ermittelt werden.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die von Busse et al. beschriebene
dämpfende Wirkung von CD4+ T-Zellen auf die lokale antimikrobielle Abwehrreaktion des
Wirts [28] wahrscheinlich nicht durch CD4+ Foxp3+ Tregs verursacht ist.
Abbildung 11: Kein Einfluss einer verzögerten Treg-Depletion auf die Zellzahl oder
Zusammensetzung des peritonealen Zellinfiltrats in der CASP
DEREG-Mäuse wurden therapeutisch 4 h vor Induktion der Sepsis mit 1 µg DT i.v. behandelt. 20 h nach
CASP wurden die sich in der Peritonealhöhle befindlichen Zellen durch Lavage mit 5 ml PBS, das 10 %
fötales Kälberserum enthielt, gewonnen. Als Kontrollen dienten PBS-behandelte DEREGs und DT-
behandelte C57Bl/6-Mäuse nach CASP und entsprechend nicht-septische Tiere. Die gewonnene
Gesamtzellzahl wurde bestimmt und auf das in der Lavage zurückerhaltene Volumen bezogen (A).
Durchflusszytometrisch wurde anschließend der Anteil der Makrophagen (Mac3+) und der Neutrophilen
(Ly6G+) am Zellinfiltrat bestimmt (B,C). Dargestellt sind die Mediane der entsprechenden Gruppen;
n = 5-6 Tiere/ Gruppe
Ergebnisse
49
4.5 Einfluss der Foxp3+ Tregs auf den Aktivierungsstatus des Immunsystems
unter basalen und septischen Bedingungen
Weder die Experimente zur bakteriellen Streuung noch zur Stärke der initialen lokalen
Immunantwort des Wirts konnten die Verstärkung der Krankheitssymptome erklären, die
nach Treg-Depletion beobachtet wurde. Deshalb sollte im Folgenden der Einfluss der
Depletion auf die systemische Entzündungsantwort und den Aktivierungsstatus der
verbleibenden CD4+Foxp3- Effektor-T-Zellen (Teff) beleuchtet werden. Dafür wurde die
Expression der Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4 und ICOS auf Teff-Zellen und die
systemischen Konzentrationen verschiedener Zytokine im Serum unter septischen und nicht-
septischen Bedingungen bestimmt.
4.5.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell
Schon unter nicht-inflammatorischen Bedingungen konnte bereits 3 Tage nach der ersten DT-
Gabe in der Milz von prophylaktisch Treg-depletierten DEREGs eine Verdopplung des
Anteils von CD69-positiven (DEREG-DT vs. DEREG-PBS: 10,3 % vs. 4,6 %; P < 0,05), von
ICOS-positiven (28,8 % vs. 15,2 %; P < 0,01) und von CTLA-4-exprimierenden CD4+Foxp3-
Teff (5,9 % vs. 1,9 %; P < 0,01) beobachtet werden (Abbildung 12A-C).
In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen waren auch die Serumkonzentrationen von TNF
(DEREG-DT vs. DEREG-PBS: 12,5 pg/ml vs. 5,6 pg/ml; P < 0,05), MCP-1 (169,4 pg/ml vs.
73,5 pg/ml; P < 0,01) und IL-6 (5,2 pg/ml vs. 1,7 pg/ml, P < 0,05) in Treg-depletierten
DEREGs zu diesem Zeitpunkt um den Faktor 2 erhöht (Abbildung 12D-F). Auch im Peritoneum
fanden sich auf niedrigem Grundniveau signifikant erhöhte Zytokinkonzentrationen
(TNF: 5,3 pg/ml vs 1,4 pg/ml, P < 0,01; MCP-1: 31,4 pg/ml vs 0 pg/ml; P < 0,01). Keine
Unterschiede ergaben sich dagegen in den Serumspiegeln von IL-10 und IFN.
Diese Daten sprechen für eine kontinuierliche Treg-vermittelte Suppression der Teff- Zellen
im Steady State und zeigen, dass das Immunsystem in Treg-depletierten Mäusen vor
Induktion der Sepsis durch CASP aktiviert war. Diese Präaktivierung liefert eine mögliche
Erklärung für den schwereren Symptomverlauf dieser Mäuse, der in den ersten Stunden nach
Sepsisinduktion besonders ausgeprägt war.
Ergebnisse
50
Abbildung 12: Einfluss der prophylaktischen Treg-Depletion auf die Aktivierung von
Effektor-T-Zellen und die Zytokinkonzentrationen im Serum unter basalen und septischen
Bedingungen
Mit DT vorbehandelte DEREG-Mäuse wurden entweder einer CASP-OP unterzogen oder ohne
weitere Behandlung belassen. PBS-vorbehandelte DEREG-Tiere und DT-vorbehandelte C57Bl/6-
Mäuse dienten als Kontrollen. 20 h später wurden Blut und Milz gewonnen und die Expression
der Aktivierungsmarker CD69, ICOS und CTLA-4 auf Teff analysiert (A-C). Die Treg-Depletion
führte zur Verdopplung des Anteils präaktivierter Teff unter basalen Bedingungen. Diese
Unterschiede wurden jedoch durch die starke systemische Aktivierung der Teff während der
CASP nivelliert. In Übereinstimmung damit waren auch die basalen Zytokinkonzentrationen im
Serum nach Treg-Depletion erhöht (D-F); nicht mehr jedoch nach Sepsisinduktion (Daten nicht
gezeigt)
Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe ; n = 4-6 Tiere/ Gruppe; *: P < 0,05; **: P < 0,01
Ergebnisse
51
Zwanzig Stunden nach CASP waren die Teff-Zellen dagegen anscheinend durch die massive
Flut eindringender Pathogene so stark aktiviert und zur Sekretion proinflammatorischer
Zytokine angeregt, dass die basalen Unterschiede im Aktivierungsstatus und in den Serum-
Zytokinkonzentrationen nach Treg-Depletion nivelliert wurden (DEREG-DT vs. DEREG-
PBS in CASP- CD69: 19,9 % vs. 18,8 %; CTLA-4: 24,3 % vs. 14,6 %; TNF: 95,6 pg/ml vs.
86,4 pg/ml; MCP-1: 1335 pg/ml vs. 1682 pg/ml; IL-6: 5545 pg/ml vs 4210 pg/ml; IL-
10: 1221 vs. 970 pg/ml, P > 0,05; Abbildung 12A-C und Abbildung 13).
Des Weiteren waren auch die lokalen Konzentrationen von TNF (DEREG-DT: 114,3 pg/ml;
DEREG-PBS: 142,2 pg/ml; C57Bl/6-DT: 123,1 pg/ml), MCP-1 (4714 pg/ml vs. 3138 pg/ml
vs. 4451pg/ml), IL-6 (7227 pg/ml vs. 4081 pg/ml vs. 4312 pg/ml) und IL-10 (69,6 pg/ml vs.
66,3 pg/ml vs. 33,3 pg/ml) im Peritoneum nach der Sepsis unabhängig von der Anwesenheit
von Tregs stark erhöht (Abbildung 13) .
Abbildung 13: CASP führt zur Nivellierung der durch die Treg-Depletion erhöhten basalen Serum-
zytokinkonzentration
DT- vorbehandelte DEREG-Mäuse und entsprechende Kontrolltiere wurden einer CASP unterzogen.
20 h später wurden Serum (obere Reihe) und Peritoneallavage-Flüssigkeit (untere Reihe) gewonnen und
die Konzentrationen von TNF, MCP-1, IL-6 und IL-10 bestimmt.
Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe; n = 5-6 Tiere/ Gruppe
Ergebnisse
52
4.5.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion
Bisher hatten sich ähnliche Ergebnisse in dem prophylaktischen und in dem verzögerten
Depletionsansatz gezeigt: Unverändertes Überleben bei schwererem Krankheitsverlauf und
keine Beeinflussung der lokalen Abwehrreaktion. In Anbetracht der Präaktivierung des
Immunsystems durch die prophylaktische Treg-Depletion stellte sich die Frage, ob auch in
der deutlich kürzeren Zeit einer verzögerten Depletion ein erhöhter basaler Aktivierungsstatus
des Immunsystems ausgelöst wurde.
Aus diesem Grund wurde auch in diesem Ansatz die basale Expression der
Aktivierungsmarker CD69, ICOS und CTLA-4 auf Teff-Zellen und die basalen
Zytokinspiegel von TNF, MCP-1 und IL-6 im Serum 24 h nach DT-Gabe analysiert.
Dabei zeigte sich, dass zwar die späteren Aktivierungsmarker CTLA-4 (DEREG-DT vs.
DEREG-PBS: 0,4 % vs. 0,82 % CTLA4+/CD4+Foxp3-; P > 0,05; Abbildung 14C) und ICOS
(11,2 % vs. 8,3 % ICOS+/CD4+Foxp3-; P > 0,05; Abbildung 14B) nicht signifikant in ihrer
basalen Expression auf Foxp3- Teff erhöht waren. Dagegen war beim sehr frühen
Aktivierungsmarker CD69 bereits eine hoch signifikante Zunahme der Expression unter
nicht-inflammatorischen Bedingungen zu erkennen (7,4 % vs. 5,4 % CD69+/CD4+Foxp3-;
P < 0,01; Abbildung 14A).
Diese Beobachtungen wurden auch durch die Untersuchung der systemischen Zytokinspiegel
bestätigt. Bereits innerhalb der relativ kurzen Zeitspanne von 24 h nach DT-Gabe, in welcher
die Gesamtzahl der Tregs kontinuierlich abfiel, kam es zu einer gewissen Präaktivierung des
Abwehrsystems. Sowohl die Serumspiegel von TNF (DEREG-DT vs. DEREG-PBS vs.
C57Bl/6-DT: 9 pg/ml vs. 0 pg/ml vs. 2,2 pg/ml; P < 0,05) als auch von MCP-1 (62,8 pg/ml
vs. 0 pg/ml vs. 9,1 pg/ml; P < 0,05) waren signifikant erhöht (Abbildung 14). Während auch die
Konzentration von IL-10 signifikant erhöht war (11,9 pg/ml vs. 0 pg/ml vs. 0 pg/ml) zeigten
sich bei IL-6 keine signifikanten Unterschiede.
Ergebnisse
53
Abbildung 14: Eine verzögerte Treg-Depletion führt innerhalb von 24 h zur Erhöhung des
basalen Aktivierungsgrades
Zur Ermittlung des Einflusses einer verzögerten Treg-Depletion auf den Aktivierungsstatus des
Immunsystems wurden 24 h nach einmaliger DT-Applikation Splenozyten und Serum von
DEREG-Mäusen gewonnen. Anschließend wurde die Expression von CD69, ICOS und CTLA-4
auf den verbleibenden CD4+Foxp3+ Teff-Zellen und die Konzentration der pro-inflammatorischen
Zytokine TNF, MCP-1 und IL-6 im Serum bestimmt. Als Kontrollen dienten PBS-behandelte
DEREGs und DT-behandelte C57Bl/6-Mäuse, sowie entsprechend behandelte Tiere 20 h nach
CASP.
Dargestellt sind die Mediane der jeweiligen Gruppen, n = 5 Tiere/ Gruppe, *: P < 0,05 **: P < 0,01
Ergebnisse
54
Diese Daten sprechen für eine geringgradige Aktivitätssteigerung des Immunsystems bei
langsam abnehmender Treg-vermittelter Suppression. Dadurch wird deutlich, dass die
Präaktivierung des Immunsystems Zeit braucht.
Mit diesem Ansatz bestätigte sich erneut, dass in der Sepsis eine Maximalaktivierung des
Immunsystems als Reaktion auf die eindringenden Mikroorganismen vorliegt, welche von
den Tregs nicht kontrolliert werden kann. So zeigten sich in den lokalen und systemischen
Zytokinkonzentrationen 20 h nach CASP auch hier keine signifikanten Unterschiede mehr
(DEREG-DT vs. DEREG-PBS vs. C57Bl/6-DT im Serum: TNF 5,9 pg/ml. vs. 91,4 pg/ml vs.
20,1 pg/ml; MCP-1 1815 pg/ml vs. 25948 pg/ml vs. 1729 pg/ml; IL-6 93 pg/ml vs.
4367 pg/ml vs. 180 pg/ml; IL-10 0 pg/ml vs. 653 pg/ml 93 pg/ml). Die Konzentrationen
einiger Zytokine erschienen tendenziell erniedrigt, jedoch war die interindividuelle
Variabilität so groß, dass keine Schlussfolgerungen möglich sind.
Abbildung 15: CASP führt zur Nivellierung der durch die Treg-Depletion erhöhten basalen Serum-
zytokinkonzentration im verzögerten Depletionsansatz
DT- vorbehandelte DEREG-Mäuse und entsprechende Kontrolltiere wurden einer CASP unterzogen.
20 h später wurden Serum (obere Reihe) und Peritoneallavage-Flüssigkeit (untere Reihe) gewonnen und
die Konzentrationen von TNF, MCP-1, IL-6 und IL-10 bestimmt.
Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe; n = 5-6 Tiere/ Gruppe
Ergebnisse
55
Auffällig in diesem Ansatz war dagegen der Phänotyp der Teff in Treg-depletierten DEREGs
20 h nach CASP. Während CD69 (Unbehandelt vs. CASP: 7,4 % vs. 13,7 %
CD69+/CD4+Foxp3-; P < 0,01; Abbildung 14A) unabhängig von der sinkenden Treg-Zahl in der
Sepsis stark hochreguliert wurde, zeigte sich keine Expressionssteigerung von CTLA-4
(0,4 % vs. 2,1 % CTLA4+/CD4+Foxp3-; Abbildung 14C). Auch histologisch konnte in der Milz
von Treg-depletierten DEREGs gezeigt werden, dass Teff-Zellen nach CASP CTLA-4-
negativ blieben (Abbildung 16). In nicht-depletierten Tieren konnte dagegen eine deutliche
CTLA-4-Expression auf Foxp3- Teff-Zellen nach der CASP sowohl durchflusszytometrisch
als auch histologisch nachgewiesen werden (Abbildung 14C und Abbildung 16).
Abbildung 16: Gestörte CTLA-4-Expression auf murinen Teff-Zellen nach verzögerter Treg-
Depletion und CASP
Zur Beurteilung der CTLA-4-Expression 20 h nach CASP-induzierter Sepsis in PBS-vorbehandelten
DEREGs (A) und verzögert Treg-depletierten Tieren (B) wurden Kryostatschnitte der asservierten
Milzen angefertigt und immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Gefärbt wurde dafür mit aCD4-
Alexa647 (blau), aFoxp3-Alexa488 und purified aCTLA-4, der über einen biotinylierten aHamster-Ak
und Streptavidin-TRITC (rot) angefärbt wurde. Weiße Pfeile markieren CTLA-4+Foxp3- Teff-Zellen.
n= 4 Tiere/ Gruppe ; jeweils ein Überlagerungsbild exemplarisch dargestellt
DEREG-PBS-CASP DEREG-DT-CASP
Ergebnisse
56
4.6 Untersuchungen zum Ausschluss einer transienten Foxp3+-Expression in
aktivierten Teff-Zellen
Im humanen System wurde gezeigt, dass aktivierte Teff-Zellen transient Foxp3-positiv
werden [54]. Dieses Phänomen ist in der Maus bisher nicht beschrieben. Da Foxp3 als
Transkriptionsfaktor die Expression von verschiedenen Effektormolekülen in Tregs
kontrolliert, ist seine Expression auch mit einer hohen Dichte von CTLA-4 in der Zelle
assoziiert [96]. CTLA-4 wird allerdings in der Maus nicht ausschließlich auf Tregs exprimiert
sondern auch auf aktivierten Teff-Zellen [97]. Bisher war unklar, ob die Expression von
CTLA-4 hier unter der Kontrolle einer transienten Foxp3-Expression steht.
In diesem Kontext war es erstaunlich, dass im hier vorgestellten verzögerten Depletionsansatz
selbst 20 h nach Sepsisinduktion kein CTLA-4 auf Teff-Zellen zu finden war. Wir vermuteten
deshalb, dass aktivierte Teff-Zellen nicht nur CTLA-4, sondern obendrein transient Foxp3
exprimiert hatten. Da in der DEREG-Maus auch der DTR unter der Kontrolle des Foxp3-
Lokus steht, würde DT, das 4 h nach Applikation noch im System ist, transient Foxp3+
exprimierende CTLA-4+ Teff-Zellen in Apoptose schicken.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden DEREG-Mäuse prophylaktisch Treg-depletiert
(DT an den Zeitpunkten -48 h und -24 h vor CASP), um eine natürliche Foxp3-Expression in
diesen Tieren auszuschalten. Dabei wurde davon ausgegangen, dass 24 h nach der letzten
Applikation kein DT mehr im System ist. Zum Zeitpunkt t0 wurden die depletierten Tiere
dann einer CASP-Operation unterzogen. Zeitgleich erhielt eine Gruppe erneut DT, um
transient Foxp3-positive Zellen über den ko-exprimierten DTR zu depletieren. Eine zweite
Gruppe erhielt als Volumenkontrolle steriles PBS. Als Read-Out wurde die CTLA-4-
Expression nach CASP analysiert
Im Ergebnis zeigten sich in beiden Gruppen hohe Expressionsgrade von CTLA-4 auf Teff-
Zellen 20 h nach Sepsisinduktion (DT vs. PBS: 29,9 % vs. 16,0 % CTLA-4+/CD4+Foxp3-;
P = 0,40) (Abbildung 17). In der DT-Gruppe schien die CTLA-4-Expression sogar tendenziell
erhöht zu sein, auch wenn sich hier durch die relativ große Streuung keine signifikanten
Unterschiede ergaben.
Insgesamt legen die hier gewonnenen Daten nahe, dass die CTLA-4-Expression auf Teff-
Zellen in der CASP unabhängig von der Anwesenheit von DT ist. Das Auftreten von transient
CTLA-4+Foxp3+ Teff-Zellen im verzögerten Depletionsansatz wird damit unwahrscheinlich.
Ergebnisse
57
Im verzögerten Depletionsansatz muss deshalb wahrscheinlich von einem direkten Einfluss
der in Apoptose begriffenen Tregs oder einer durch die Depletion ausgelösten Apoptose-
induzierten Anergie in Teff-Zellen ausgegangen werden.
Abbildung 17: Kein Einfluss einer unmittelbaren Anwesenheit von DT im System auf
CTLA-4 Expression auf Teff-Zellen
Um das Auftreten von transient CTLA-4+Foxp3+Teff-Zellen im verzögerten Depletionsansatz
auszuschließen, wurden DEREG-Mäuse prophylaktisch an t-2= -48 h und t-1= -24 h mit DT
vorbehandelt. Zum Zeitpunkt t0= wurden beide Gruppen einer CASP unterzogen. Dabei erhielt
eine Gruppe zeitgleich DT (schwarz ausgefüllte Kreise) während die andere als Volumenkontrolle
PBS erhielt (schwarz gerahmte Rechtecke). Als Read-Out wurde 20 h nach der CASP die
Splenozyten isoliert und die CTLA-4 Expression auf CD4+Foxp3- Teff-Zellen bestimmt.
Dargestellt sind jeweils die Mediane beider Gruppen; n = 3 Tiere/Gruppe; n.s.: nicht signifikant
Ergebnisse
58
4.7 Serumkonzentrationen von IL-9 und IL-17 in der Sepsis
IL-17 ist ein Mitglied der IL-17-Zytokinfamilie, das zahlreiche Funktionen innerhalb des
Immunsystems hat. Es wird unter anderem von Typ 17 T-Helfer-Zellen (Th17-Zellen)
gebildet und wirkt synergistisch mit TNF und IL-6. Durch Aktivierung von Makrophagen,
Endothelzellen und Fibroblasten kann es zur Gefäßaktivierung, zu vielfältigen Entzündungs-
reaktionen und zur Zerstörung der extrazellulären Matrix führen [98]. Es gibt Hinweise auf
eine reziproke Regulation von Th17-Zellen und Tregs [99]; auch wurde beim Menschen
beobachtet, dass Tregs in Anwesenheit von IL-6 und IL-1 selbst zur IL-17 Sekretion
stimuliert werden [100]. Deshalb sollte geprüft werden, welchen Einfluss eine Treg-Depletion
auf die Serumkonzentration dieses Zytokins im CASP-Modell hat. Auch IL-9 gelangte in den
Fokus des Interesses. Dieses Zytokin ist ein potenter Wachstumsfaktor für T-Zellen, induziert
die Bildung von Th17-Zellen und verstärkt die suppressorischen Eigenschaften von Foxp3+
regulatorischen T-Zellen [101].
Um den Einfluss einer generalisierten mikrobiellen Infektion auf die Serumkonzentrationen
von IL-9 und IL-17 zu bestimmen und den Effekt einer Treg-Depletion auf diese zu
untersuchen, wurden DT-vorbehandelte DEREG-Mäuse einer CASP unterzogen. Als
Kontrollen dienten PBS-vorbehandelte DEREGs und DT-vorbehandelte C57Bl/6- Mäuse
nach CASP und entsprechend unbehandelte Tiere.
Überraschenderweise zeigte sich bei allen Gruppen eine signifikante Abnahme der Serum-
spiegel von IL-9 20 h nach CASP im Vergleich zu nicht-septischen Kontrolltieren
(Unbehandelt vs. CASP :DEREG-DT 860 vs. 227 pg/ml, P < 0,01; DEREG-PBS 972 vs.
365 pg/ml, P < 0,01; C57Bl/6 1220 vs. 561 pg/ml, P = 0,057; Abbildung 18). Diese Daten
deuten darauf hin, dass unabhängig von einer Treg-vermittelten Suppression die Serumspiegel
dieses potenten Wachstumsfaktors für T-Zellen in der Sepsis fallen. Auffällig ist jedoch, dass
sowohl unter septischen als auch unter nicht-septischen Bedingungen die Konzentrationen in
Treg-depletierten DEREGs im Vergleich zu C57Bl/6 Mäusen signifikant erniedrigt waren.
Ergebnisse
59
Auch die Konzentrationen von IL-17 waren in septischen Tieren tendenziell, aber nicht
signifikant erniedrigt (Unbehandelt vs. CASP: DEREG-DT 60 vs. 23 pg/ml; DEREG-PBS 64
vs. 38 pg/ml; C57Bl/6-DT 77 vs. 56 pg/ml, P > 0,05; Abbildung 18)
Im verzögerten Depletionsansatz wurden die beschriebenen Beobachtungen tendenziell aber
durch die teilweise sehr geringen auswertbaren Gruppengrößen nicht signifikant bestätigt
(siehe Anhang: Abbildung 19). Die Robustheit des zuvor beschriebenen Effekts wird deshalb zu
hinterfragen sein. Da die Auswirkungen von akutem Stress, wie er durch eine i.v. Applikation
im verzögerten Ansatz gesetzt wird, auf die folgende Immunantwort umfassend in der
Literatur beschrieben ist, kann hier eine Beeinflussung durch erhöhte Katecholamin- oder
Glukokortikoidspiegel nicht ausgeschlossen werden.
Abbildung 18: CASP führte zu veringerten Serum-Konzentrationen von IL-9 und IL-17
DT-vorbehandelte DEREG- und C57Bl/6- Mäuse als auch PBS-vorbehandelte DEREG-Tiere wurden einer
CASP-Operation unterzogen. 20 h später wurde das Blut gewonnen und die Konzentrationen von IL-9 und
IL-17 im Serum bestimmt. CASP führte zu einer signifikanten Abnahme der IL-9-Spiegel, während die
Konzentration von IL-17 im Serum nur tendenziell erniedrigt war.
Dargestellt sind die Mediane jede Gruppe; n = 3-6 Tiere/ Gruppe; *: P < 0,05 **: P < 0,01
Diskussion
60
5 Diskussion
5.1 Größe und Aktivierungsstatus der Treg - Population im Kontext einer
polymikrobiellen Sepsis
Am Anfang dieser Arbeit stand die Beobachtung, dass eine fulminante, fäkale Peritonitis das
systemische Verhältnis zwischen CD4+Foxp3+ Tregs und CD4+Foxp3- Teff-Zellen stark
zugunsten der Tregs verschiebt. Dies zeigte sich eindrucksvoll in einer Verdopplung des
Anteils Foxp3-exprimierender Zellen in der Population der CD4+ Splenozyten 20 h nach
CASP-induzierter Sepsis.
In bisherigen Untersuchungen zum Einfluss generalisierter Infektionen und schwerer
Traumata wurde diese Zellpopulation zumeist über die konstitutive Co-Expression von CD4
und CD25 charakterisiert. So fanden Scumpia et al. im murinen Sepsismodell der Cecal
ligation and Puncture (CLP) den prozentualen Anteil der CD4+CD25+ Tregs durch die
generalisierte Infektion um den Faktor 2 bis 2,5 erhöht [90]. Darüber hinaus wurde beim
Menschen durch Monneret et al. [103] und Venet et al. [104, 105] gezeigt, dass der
prozentuale Anteil dieser Zell-Population im peripheren Blut von Patienten im septischen
Schock stark erhöht ist. Die Autoren vermuteten eine Suppressionsverstärkung, die eine
Ursache für die Entwicklung einer oft letal verlaufenden Immunparalyse im Sepsisgeschehen
sein könnte. Diese Effekte scheinen dabei nicht auf mikrobiell ausgelöste Immunreaktionen
beschränkt zu sein. So wurden auch in murinen Traumamodellen nach großflächigen
Verbrennungen [106] und im Blut von Patienten mit akutem Schlaganfall [107] relativ
erhöhte Treg-Zahlen gefunden. Wenn auch massive Traumen und großflächige
Gewebszerstörungen zu einer Verschiebung des Treg/Teff-Verhältnisses führen, ist dies nicht
infektionsspezifisch. Insgesamt sind die in der Literatur beschriebenen Beobachtungen
konsistent mit den Ergebnissen dieser Arbeit für CD4+Foxp3+ Tregs im CASP-Modell.
Wodurch wird dieser starke prozentuale Anstieg der Tregs in der Sepsis ausgelöst? Eine
mögliche Erklärung könnte die periphere Konversion von Foxp3- T-Zellen zu
Foxp3+ induzierten Tregs sein. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass Tregs nicht nur
im Thymus generiert werden können. Vielmehr scheint auch in der Peripherie eine Induktion
der Foxp3-Expression in naiven T-Zellen möglich zu sein. Zu den wichtigen
Voraussetzungen gehört der Einfluss von TGF- [108-110]. Da Foxp3 eng mit den immun-
Diskussion
61
modulatorischen Funktionen von Tregs assoziiert ist [49, 111], zeigen diese iTregs ebenfalls
ein ausgeprägtes suppressorisches Potential [109] und sind phänotypisch kaum von
natürlichen Tregs aus dem Thymus zu unterscheiden.
Es muss jedoch neben der Möglichkeit der T-Zellkonversion auch ein zweiter
Erklärungsansatz in Betracht gezogen werden. Untersuchungen in vitro und in vivo haben im
humanen und murinen System deutlich belegt, dass sich Tregs im Vergleich zu Teff-Zellen
durch eine relative Apoptoseresistenz auszeichnen [112-114]. Sie könnten also bei Sepsis, die
mit massivem Zelltod von Immunzellen einhergeht, einen Überlebensvorteil gegenüber Teff-
Zellen haben. Auch hierin könnte eine Ursache für die beobachtete Verschiebung des
Treg/Teff-Verhältnisses liegen. In Überstimmung damit wurde durch Venet et al. in der
humanen Sepsis gezeigt, dass der relative Anstieg der CD4+CD25+ Tregs in der Sepsis nicht
durch eine Expansion dieser Zellpopulation bedingt ist, sondern durch eine verstärkte
Apoptose von CD4+CD25- nicht-regulatorischen T-Zellen verursacht wird [104]. Auch
Scumpia et al. konnten eine signifikante Zunahme der Absolutzellzahl der Tregs erst 3 Tage,
nicht aber 24 h nach Sepsisinduktion beobachten [90]. In dieser Arbeit war die Absolutzahl
von CD4+Foxp3+ Tregs 20 h nach Sepsisinduktion tendenziell, aber nicht signifikant, erhöht.
Dies legt den Schluss nahe, dass hauptsächlich der Tod von Teff-Zellen für das verschobene
Treg/Teff-Verhältnis verantwortlich ist. Diese Hypothese wird zusätzlich gestützt durch
in vitro Untersuchungen zur Kinetik der Foxp3-Induktion in naiven T-Zellen. Selvaraj und
Geiger zeigten, dass nur ein enges kinetisches Fenster nach TCR-Stimulation zur Induktion
von Foxp3 durch TGF- besteht und dass eine Foxp3-Expression erst mit einer Verzögerung
von 2 Tagen nachweisbar war [115]. Auch wenn sich dies nicht unmittelbar auf die Situation
in vivo übertragen lässt, ist es doch unwahrscheinlich, dass bereits 20 h nach Sepsisinduktion
eine periphere Konversion stattgefunden hat, die den relativen Anstieg des Treg-Anteils
erklären könnte. Trotz alledem kann diese Möglichkeit oder auch ein Zusammenspiel von
Apoptoseresistenz und peripherer Konversion nicht völlig ausgeschlossen werden.
Ein weiteres zentrales Anliegen dieser Arbeit bestand darin zu beleuchten, wie endogene
CD4+Foxp3+ Tregs auf den Stimulus einer diffusen Peritonitis reagieren. Sowohl im murinen
CLP-Modell als auch in der humanen Sepsis wurde bisher beschrieben, dass die CD4+CD25+
Treg-Population bei Sepsis nicht aktiviert werden, weil sie CD69-negativ und CD45RO-
positiv bleiben [90, 103, 116]. Diese Beobachtungen stehen teilweise im Widerspruch zu den
Ergebnissen dieser Arbeit.
Diskussion
62
Bei Vergleichen mit älteren Studien gilt es allerdings zu bedenken, dass der dort zumeist
verwendete Marker CD25 nicht als Treg-spezifisch anzusehen ist. Vielmehr wird CD25 zum
einen auch auf aktivierten Teff-Zellen hochreguliert [117, 118], zum anderen gibt es in
einigen peripheren Geweben CD25-negative Tregs [119]. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass
bei Fokussierung auf CD4+CD25+ Treg-Zellen eine heterogene Population untersucht wurde,
was die Interpretation der Daten erschwert. Wenngleich auch für Foxp3 im humanen System
eine transiente Expression in aktivierten Teff-Zellen beschrieben wurde [55], ist dieses
Phänomen in der Maus bisher nicht beobachtet worden. Der in dieser Arbeit als Treg-Marker
verwendete Foxp3-Transkriptionsfaktor ist damit im murinen System weiterhin der
spezifischste Marker für diese Zellpopulation.
In teilweisem Widerspruch zu den Ergebnissen von Scumpia et al. [90] konnte hier gezeigt
werden, dass offensichtlich schon in der frühen hyperinflammatorischen Phase ein großer Teil
der CD4+Foxp3+ Tregs die Expression der Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4 und ICOS
stark hochregulierte. Dies zeigte sich eindrucksvoll in einer Verdreifachung des Anteils
CD69-positiver und CTLA-4-exprimierender Tregs in der Milz 20 h nach CASP. Diese
Ergebnisse legen nahe, dass auch endogene Foxp3-positive Tregs von der systemischen
Infektion in der Sepsis nicht unbeeinflusst bleiben, sondern auf die Überflutung des
Organismus mit endogenen Darmbakterien rasch mit Aktivierung reagieren.
Lehrbuchmeinung war bisher, dass für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems mehrere
Tage notwendig sind. Dies ließ es sehr unwahrscheinlich escheinen, dass diese Zellen eine
hoch akut verlaufende Sepsis beeinflussen könnten. Im Gegensatz dazu wurde in dieser
Arbeit eine rasche und systemische Aktivierung von CD4+Foxp3+ Tregs in der CASP
beobachtet. Es stellt sich nun die Frage, wie diese Zellen in der Sepsis aktiviert werden. Es
sind dafür mehrere Möglichkeiten vorstellbar. Im Verlauf einer generalisierten Infektion
kommt es erstens durch die Invasion der Pathogene selbst und zweitens in Folge der starken
proinflammatorischen Abwehrreaktion des Wirtes zu ausgedehnten Gewebsdestruktionen.
Dadurch werden Selbstantigene des Wirts für Zellen des Abwehrsystems frei zugänglich
[120, 121]. Natürliche Tregs, welche im Thymus reifen und zum großen Teil Selbst-Antigen-
spezifische TCRs tragen [122, 123], könnten durch die Präsentation dieser Selbst-Antigene
und entsprechende ko-stimulatorische Signale aktiviert und zur Expression verschiedener
Effektormoleküle angeregt worden sein. Zweitens gilt als gesichert, dass Tregs Toll-like- und
andere Rezeptoren zur Erkennung konservierter mikrobieller Strukturen und Danger
Associated Molecular Patterns (DAMPs) auf ihrer Oberfläche tragen [56, 57]. Durch die
Diskussion
63
Ligation dieser Rezeptoren können Tregs einerseits schnell aktiviert und in ihrer suppressiven
Eigenschaft verstärkt andererseits aber auch selbst supprimiert werden [124].
Ob aktivierte Tregs in der Sepsis eine pathophysiologisch bedeutsame Suppression auf die
Immunantwort ausüben und damit den von Busse et al. [28] beschrieben dämpfenden Effekt
auf die lokale Immunantwort vermitteln, lässt sich auf der Basis dieser Überlegungen nicht
vorhersagen.
5.2 Rolle und Funktion der Foxp3+ Tregs in der murinen Sepsis
Um die Rolle der Tregs bei der Sepsis zu beleuchten, wurde in dieser Arbeit ein Mausmodell
eingesetzt, das die induzierte Depletion von Foxp3+ Tregs nach dem Prinzip des Toxin-
Rezeptor-vermittelten konditionalen Zell-Knock-Outs (TRECK) [125] ermöglicht.
In der Literatur ist umfänglich beschrieben, dass murinen WT-Zellen ein funktioneller
Diphtherierezeptor fehlt, so dass sie unfähig zur Aufnahme des Diphtherie-Toxins und
deshalb resistent gegen seine Proteinbiosynthese-inhibierende Wirkung sind [126, 127]. Die
in dieser Arbeit verwendete transgene DEREG-Maus exprimiert dagegen einen DT-Rezeptor
unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus [39], was die selektive Depletion der Foxp3-positiven
Tregs mit Diphtherietoxin ermöglichte. Damit konnte untersucht werden, wie sich die
Immunantwort des Wirts auf die generalisierte Infektion in der CASP ändert, wenn Tregs
prophylaktisch oder verzögert aus dem System entfernt werden.
Es zeigte sich, dass durch eine prophylaktische Depletion von endogenen Foxp3+ Tregs vor
der CASP weder (1.) das Ausmaß der lokalen Abwehrreaktion im Peritoneum, noch (2.) die
systemische Immunantwort, oder (3.) die bakterielle Streuung verändert wurden. Diese
Ergebnisse konnten auch in einem zweiten Ansatz mit verzögerter Depletionsstrategie
bestätigt werden. In diesem experimentellen Ansatz sollte eine eventuell dämpfende Wirkung
der Tregs auf die sehr frühe Hyperinflammation und die damit verbundenen
Immunpathologien aufrechterhalten werden. Im Nachhinein kann nicht sicher ausgeschlossen
werden, dass Tregs bereits direkt nach der DT-Applikation in ihrer Proteinbiosynthese
inhibiert [128] und damit in der Hyperinflammation nicht mehr ansprechbar waren. Dennoch
konnte in diesem Ansatz zumindest die Interferenz mit der durch die Treg-Depletion
ausgelösten Präaktivierung des Immunsystems dadurch minimiert werden, dass die Zeit, in
welcher Teff-Zellen vor der Sepsisinduktion ohne Treg-vermittelte Kontrolle waren,
Diskussion
64
möglichst gering gehalten wurde. Aus den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen zur
prophylaktischen und verzögerten Treg-Depletion lässt sich deshalb zusammen klar
schlussfolgern, dass endogene CD4+Foxp3+ Tregs keinen Einfluss auf die Stärke und
Ausprägung der lokalen und systemischen Immunantwort in der hyperinflammatorischen
Phase einer CASP-induzierten Sepsis haben. Sie können damit das Überleben nicht
signifikant beeinflussen.
Damit sind diese Daten in prinzipieller Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die sowohl
Scumpia et al. [90] als auch Wisnoski et al. [91] in der CLP über eine Anti-CD25-Antikörper-
vermittelte Depletionsstrategie der Tregs erhalten haben. Auch hier zeigten sich weder das
Überleben noch die systemische Immunantwort in der Sepsis durch die prophylaktische
Ablation der CD4+CD25+ Tregs verändert. Ein Widerspruch ergibt sich dagegen zu den
Ergebnissen von Chen et al. [129], die bei einer Antikörper-vermittelten Depletion von
CD4+CD25+ Tregs vor CLP-induzierter Sepsis ein deutliche Steigerung der Überlebensraten
beobachten konnten. Allerdings lassen sich die genannten Studien mit dieser Arbeit nicht
unbedingt vergleichen. So wurde durch Couper et al. publiziert, dass die Behandlung mit dem
von allen genannten Gruppen verwendeten Anti-CD25-Antikörper (PC61) lediglich zu einer
inkompletten Depletion führt und CD25lowFoxp3+ und CD25-Foxp3+ Tregs durch den
Antikörper nicht erfasst werden [130]. Dieselbe Arbeitsgruppe zeigte im murinen
Malariamodell nach einer Anti-CD25-Behandlung eine rasche Repopulation der
CD4+CD25+Foxp3+ Tregs durch Expansion der CD4+CD25-Foxp3+ Zellen und eine
Hochregulation von CD25 [130]. Es ist deshalb unklar, wie sich eine Anti-CD25-Antikörper-
vermittelte Ablation von Tregs auf diese heterogene Zellpopulation vor der Sepsisinduktion
und auf ihre Repopulation in der Sepsis selbst auswirkt. Auch kann nicht ausgeschlossen
werden, dass dieser Antikörper, der sich nach der Sepsisinduktion noch im System befindet,
auch aktivierte Effektor-T-Zellen depletiert, die ebenfalls CD25 exprimieren. Die Depletion
von endogenen Tregs nach dem Kriterium der Foxp3-Expression, wie sie in dieser Arbeit
eingesetzt wurde, ist spezifischer.
Zwei weitere Gründe erschweren den direkten Vergleich der hier gezeigten mit den in der
Literatur beschriebenen Ergebnissen. Erstens sind Depletionsstrategien per se immer ein
Eingriff ins Gesamtsystem des Organismus. Fraglich ist, ob die Ergebnisse einer Antikörper-
vermittelten Zelllyse mit einer DT-vermittelten Apoptoseinduktion [131] verglichen werden
können, denn apoptotischer Zelluntergang beeinflusst das Immunsystem anders als
nekrotischer Zelltod [132]. Zweitens wurde in dieser Arbeit ein anderes Modell zur
Diskussion
65
Sepsisinduktion gewählt. Maier et al. [133] haben gezeigt, dass das CASP-Modell sehr gut
die klinische Situation einer diffusen Peritonitis mit kontinuierlich ins System flutenden
Darmbakterien abbildet, während die CLP die intra-abdominale Abszess-Formation mit
geringerer systemischer Entzündungsreaktion modelliert [133].
Es gilt festzuhalten, dass nach dieser Arbeit zwar deutlich ist, dass CD4+Foxp3+ Tregs den
von Busse et al. [28] beschriebenen negativen Effekt der CD4+ T-Zellen auf die lokale
Immunantwort und das Überleben in der CASP nicht vermitteln, daraus kann jedoch nicht
zwangsläufig geschlussfolgert werden, dass die in sich heterogene Population der
regulatorischen T-Zellen in ihrer Gesamtheit keine Rolle in der Sepsis spielt. Auch könnten
die anti-CD4 Antikörper weitere Zelltypen beeinflusst haben. So sind in der Literatur auch
CD4-exprimierende -T-Zellen oder NKT-Zellen mit suppressorischem Potential
beschrieben, deren Rolle in der Sepsis bisher nicht aufgeklärt ist [92]. Auch Nebeneffekte
einer Depletion von myeloiden dendritischen Zellen, welche teilweise ebenfalls CD4 auf der
Oberfläche tragen [134], kann bei Busse et al. nicht ausgeschlossen werden. Letztendlich
muss in Zukunft auch der Einfluss von peripheren iTregs hinterfragt werden, welche nicht
unmittelbar in der Sepsis durch periphere Konversion entstanden sind, sondern schon vor der
Induktion der diffusen Peritonitis existent waren. Besonders im Darm-assoziierten
lymphatischen Gewebe gibt es viele induzierten Tregs (Tr1-, Th3- Zellen). Diese erhalten
unter anderem die periphere Toleranz gegenüber kommensalen Darmbakterien aufrecht. Da
nicht geklärt ist, ob diese iTregs Foxp3 exprimieren [135-138], ist unklar, ob diese Zellen von
der DT-vermittelte Depletionsstrategie erfasst werden. Somit können nach dieser Arbeit keine
sicheren Aussagen darüber getroffen werden, wie iTregs auf eine systemische Überflutung
mit Darmbakterien im Rahmen einer fäkalen Peritonitis reagieren.
Obwohl durch die Treg-Depletion das Überleben der Sepsis nicht beeinflusst wurde, war doch
über den gesamten Experimentalverlauf auffallend, dass depletierte Tiere eine verstärkte
Krankheitssymptomatik zeigten. Sowohl im prophylaktischen als auch im verzögerten
Depletionsansatz waren schon in den ersten Stunden nach Induktion der diffusen Peritonitis
die Belastungsscores der Treg-depletierten Tiere deutlich höher als in der Kontrollgruppe. Die
offensichtliche Diskrepanz zwischen dem unveränderten Überleben und der verstärkten
Sepsissymptomatik, wirft die Frage nach den Ursachen auf. Eine mögliche Erklärung ist die
Präaktivierung des Immunsystems durch die Treg-Depletion. Wie schon durch Kim et al. in
der Foxp3DTR-Maus beschrieben [37], zeigten sich auch in der hier vorliegenden Arbeit nach
Treg-Ablation deutlich erhöhte Expressionsgrade der Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4
Diskussion
66
und ICOS auf den verbleibenden Teff-Zellen. Auch die Zytokinkonzentrationen von TNF,
IL-6 und MCP-1 waren in den Seren dieser depletierten Tiere bereits unter homöostatischen
Bedingungen signifikant erhöht. Dieser Effekt war in DEREG-Mäusen überraschenderweise
schon 24 Stunden nach einmaliger DT-Applikation deutlich und verstärkte sich im
prophylaktischen Treg-Depletionsregime nach zweimaliger DT-Gabe zusätzlich. Zu keinem
Zeitpunkt wurde das Immunsystem in C57Bl/6-Wildtyp-Mäuse durch eine DT-Applikation
per se aktiviert. Die Daten zeigen deshalb, dass Foxp3+ Tregs schon unter nicht-
inflammatorischen Bedingungen aktiv sind und Teff-Zellen supprimieren.
Diese Interpretation wird durch den phänotypischen Vergleich von Tregs und Teff-Zellen im
Basalzustand gestützt. Tregs exprimierten bei nicht-septischen Tieren alle untersuchten
Aktivierungsmarker in höherer Dichte als Foxp3- Teff-Zellen. Tregs scheinen also permanent
aktiv zu sein, vermutlich um die Teff homöostatisch zu supprimieren. Dies erklärt, weshalb
das Immunsystem von Treg-depletierten DEREG-Mäusen zum Zeitpunkt der Sepsisinduktion
bereits präaktiviert war. Es ist zu erwarten, dass der Anstieg der proinflammatorischen
Zytokine und Effektormoleküle der Teff-Zellen bei der Sepsis in diesen Tieren schneller
erfolgen als in nicht-präaktivierten Tieren. Die vor der CASP durch die Treg-Depletion
ausgelöste Enthemmung des Immunsystem könnte somit erklären, warum in diesen Tiere die
Krankheitssymptome in den ersten Stunden der Sepsis verstärkt waren.
Diese Unterschiede im Aktivierungsstatus des Immunsystems ware jedoch 20 h nach CASP
nivelliert. Offenbar wird in der polymikrobiellen Sepsis das gesamte Immunsystems maximal
aktiviert und unterliegt dann keiner Kontrolle mehr durch Foxp3+ Tregs. Auch wenn vieles
dafür spricht, dass die Tregs die Kinetik der Immunantwort in den ersten Stunden der Sepsis
beeinflussen, kann der Gipfel der septischen Hyperinflammation durch Tregs nicht begrenzt
werden.
5.3 Warum haben hochgradig aktivierte Tregs keinen Einfluss auf die
Immunantwort in der Sepsis?
In Infektionsmodellen mit Aspergillus fumigatus [139], Schistosoma mansoni [140] und
anderen exogenen Pathogenen [48, 61, 84] wurde gezeigt, dass murine Tregs die Entwicklung
lokaler Gewebeschäden durch das Immunsystem begrenzen und damit die Überlebenswahr-
scheinlichkeit des Wirts erhöhen.
In dieser Arbeit konnte dagegen zwar eine Aktivierung von endogenen CD4+ Foxp3+ Tregs in
der polymikrobiellen Sepsis gezeigt werden, aber kein Einfluss dieser Zellpopulation auf die
Diskussion
67
Ausprägung oder Effektivität der Immunantwort. Es stellt sich deshalb die Frage, warum
gerade unter den Bedingungen einer massiven systemischen Entzündungsreaktion Tregs,
welche ein Vielzahl von Immunreaktionen dirigieren [57], nicht aktiv in die Modulation der
Pathogenabwehr eingreifen können. Zwei Erklärungsmöglichkeiten bieten sich an, die im
Folgenden diskutiert werden sollen. Einerseits könnten Tregs im Rahmen einer Infektabwehr
aktiv inhibiert werden, um eine effektive Immunreaktion zu gewährleisten. Andererseits ist
auch denkbar, dass Effektorzellen im hochgradig proinflammatorischen Milieu der Sepsis
zeitweise nicht mehr auf die Suppressionsmechanismen der Tregs antworten und für diese
refraktär werden.
In der Literatur finden sich Hinweise für ein komplexes Regulationssystem der
Immunsuppression bei Infektionen, welches Lucy S.K. Walker als „tuned suppression“
bezeichnete [141]. Experimentelle Daten, die dieses Konzept untermauern, wurden
beispielsweise für das GITR-(glucocorticoid-induced TNF-receptor family-related receptor)-
System veröffentlicht [142]. GITR wird konstitutiv auf Tregs exprimiert und findet seinen
passenden Liganden (GITRL) vor allem auf APCs [143]. Jedoch regulieren auch Teff-Zellen
GITR rasch nach Aktivierung hoch [143]. Nach Shevach und Stephans kommt dem GITR-
GITRL-System in der sehr frühen antimikrobiellen Immunreaktion eine entscheidende
Bedeutung zu [142, 143]. Die Ligation von GITR auf Teff-Zellen wirkt nämlich als ko-
stimulatorisches Signal, unterstützt die frühe Aktivierung dieser Zellen, entzieht sie
kurzfristig durch Resistenz der Kontrolle durch Tregs und ist insgesamt günstig für das
Überleben [143]. Die transiente Entkopplung der Effektorfunktionen von der Treg-
vermittelten Suppression ist in dieser Phase der Infektabwehr offenbar für eine effektive
Clearance unerlässlich. Im Verlauf der Immunantwort regulieren Teff-Zellen jedoch die
GITR-Expression rasch wieder auf Basis-Niveau herunter und nur Tregs bleiben stark GITR
positiv [143]. Die durch GITR-GITRL-Interaktion aktivierten und expandierten Tregs können
dann Teff-Zellen erneut supprimieren.
Neben GITR wird auch weiteren Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Superfamilie, wie OX-40
[144], 4-1BB [145] und dem TNF-Rezeptor Typ II (TNFRII) [146], eine entscheidende Rolle
bei der Modulation der Treg-vermittelten Suppression zugeschrieben. Der TNFRII
beispielsweise wird beim Menschen vor allem auf CD4+CD25high Tregs exprimiert und bindet
TNF. Bei Mensch und Maus gilt die pathogenetische Bedeutung von TNF im Sepsisverlauf
als umfänglich belegt. Auch in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die lokale und
systemische Konzentration dieses gemeinhin als proinflammatorisch betrachteten Zytokins in
der CASP rasch ansteigt. Durch Valencia et al. wurde jedoch beobachtet, dass TNF über den
Diskussion
68
TNFRII auch eine stark immunmodulatorische Wirkung hat und als Bindeglied zwischen
innatem und adaptiven Immunsystem in der Lage ist humane CD4+CD25high Tregs direkt zu
supprimieren und ihre FOXP3-Expression zu senken [146].
Auch bei der Maus gibt es Hinweise für eine ähnliche Wirkung von TNF. So wurde durch
Chen et al. in vitro gezeigt, dass TNF durch den TNFRII vermittelt kurzfristig das
suppressorische Potential muriner Tregs aufhebt, bei längerer Exposition jedoch eine
Expansion und deutliche Expressionsteigerung von CD25 und Foxp3 auslöst und so mit
verzögerter Kinetik ihr Inhibitionsvermögen steigert [129].
Diese Publikationen legen nahe, dass im Verlauf einer Immunantwort verschiedene
Mechanismen sicherstellen, dass die initalen Abwehrreaktionen zeitweise von der Kontrolle
durch Tregs entkoppelt werden, so dass die Elimination der invasiven Mikroorganismen
schneller und effektiver ablaufen kann. In der Sepsis könnte dadurch jedoch eine Entgleisung
der Immunantwort in einen septischen Schock mit einem letalen Zytokinsturm begünstigt
werden.
Interessanterweise führen die gleichen Mechanismen, welche die transiente Inhibition der
Tregs und die zeitweise Resistenz der Teff-Zellen vermitteln, wahrscheinlich auch zur
langfristigen Expansion und Aktivitätssteigerung der Tregs. Diese könnte wichtig sein, um
nach einer gewissen Zeit eine durch die verstärkte Inhibition der Tregs vermittelte Rückkehr
zur Immun-Homöostase zu gewährleisten. Dies bedeutet, dass Infektionen neben der
peripheren Konversion und der Apoptoseresistenz das Verhältnis zwischen Tregs und Teffs
eventuell noch durch einen dritten Mechanismus verschieben. Es ist auch denkbar, dass bei
Sepsis (CASP) durch starke proinflammatorische Signale die Hyporesponsivität und Anergie
von Tregs gebrochen wird und diese aktiv proliferieren.
Das Konzept der „tuned suppression“ [141] wird auch durch experimentelle Beobachtungen
gestützt, die zeigen dass Teff-Zellen in vitro durch starke antigen-spezifische Stimulation
zeitweise gegenüber einer Suppression refraktär werden [147]. Im Verlauf der CASP kommt
es durch die den Organismus überschwemmenden und sich rasch teilenden Pathogene schnell
zu hohen Antigenkonzentrationen, welche die Suppressionsresistenz der Teff-Zellen
gegünstigen könnten. Auch TLRs scheinen an diesem komplexen Regulationssystem beteiligt
zu sein. So wurde durch Pasare und Medzhitov beobachtet, dass die Ligation von TLR4 durch
das Lipopolysaccharid (LPS) und die Bindung von unmethylierten CpG DNA-Motiven an
TLR9 auf dendritischen Zellen (DCs) zu einer Aktivierung dieser Zellen und konsekutiv zu
einer Blockierung der suppressiven Effekte von CD4+CD25+ Tregs führt [148].
Diskussion
69
In der Zusammenschau mit den beschriebenen Daten anderer Arbeitsgruppen legen die
Ergebnisse dieser Arbeit die folgende Interpretation nahe: Bei einer polymikrobiellen Sepsis
stellen verschiedene Regulationsmechanismen in der initialen hyperinflammatorischen Phase
sicher, dass Tregs abgeschaltet und/oder Teff refraktär für deren Suppression werden. Die
„tuned suppression“ [141] fördert die effektive Pathogenabwehr. Dieses Modell würde
erklären, weshalb die Entfernung der Tregs bereits 20 h nach CASP die Stärke der
systemischen Entzündung nicht mehr beeinflusste. Die hyperinflammatorische
Abwehrreaktion bei Sepsis läuft wahrscheinlich in dieser Phase ohnehin ohne aktive
Regulation durch Tregs ab.
Dies erlaubt jedoch keine Schlussfolgerung über eine mögliche Funktion der Tregs in
späteren Phasen des Sepsisverlaufs und insbesondere in der Immunparalyse. Diese späte
Phase der Sepsis stand in dieser Arbeit nicht im Zentrum. Modelle von Sekundärinfektionen
nach überstandener Sepsis könnten in Zukunft Aufschluss darüber geben, ob Tregs nach der
Hyperinflammation wieder angeschaltet werden und in ein kompensatorisches
antiinflammatorisches Syndrom (CARS) führen.
Zusammenfassung
70
6 Zusammenfassung
Die seit Jahrzehnten nahezu unverändert hohe Letalität von Patienten mit abdomineller Sepsis
in Folge chirurgischer Nahtinsuffizienz zeigt, dass das komplexe Zusammenspiel der
verschiedenen Immunzellen in der Sepsis nicht ausreichend verstanden ist.
CD4+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) beeinflussen zahlreiche Immunreaktionen und
sind unerlässlich für die Aufrechterhaltung einer peripheren Selbsttoleranz und für die
Verhinderung von Autoimmunerkrankungen. Ihre Rolle bei generalisierten bakteriellen
Infektionen wird dagegen kontrovers diskutiert. Arbeiten aus unserem Labor deuteten auf eine
Beteiligung dieser Zellpopulation an der Dämpfung der lokalen Immunantwort, die das
Überleben im Mausmodell negativ beeinflusst.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde deshalb die DEREG-Mauslinie verwendet, um den
Einfluss einer selektiven Depletion Tregs auf die lokale und systemische Immunreaktion im
murinen Sepsismodell der Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) zu beleuchten. DEREGs
sind transgene Mäuse, die ein Fusionsprotein aus eGFP und dem Diphtherietoxin-Rezeptor
unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus exprimieren. Sie sind aktuell das beste verfügbare
Mausmodell zur Untersuchung von Foxp3+ Tregs bei Infektion, denn einerseits leuchten die
Tregs grün und lassen sich deshalb leicht identifizieren, andererseits können sie mit
Diphtherietoxin selektiv depletiert werden. Die dafür notwendige Dosis ist für die Tiere nicht
toxisch. Zur Charakterisierung des Einflusses der Tregs auf die lokale Abwehrreaktion im
Peritoneum und die systemische Hyperinflammation bei CASP wurden Überlebenskinetiken
sowie bakteriologische, durchflusszytometrische und immunfluoreszenzmikroskopische
Analysen durchgeführt
Die Sepsis führte innerhalb von 20 h zu einer systemischen Aktivierung Tregs erkennbar an
einer Steigerung der Expression verschiedener Oberflächenmoleküle. Auch das Verhältnis
zwischen Tregs und Effektor-T-Zellen (Teff) wurde durch die systemische Infektion stark
zugunsten der Tregs verschoben. In nicht septischen Tieren ließ sich klar zeigen , dass Treg-
Depletion zu einer Aktivierung des Immunsystems führte. Tregs tragen also im Basalzustand
zu einer stetigen Dämpfung des Immunsystems bei. In der Sepsis ließ sich dagegen kein
immunmodulatorischer Effekt der Tregs beobachten. Weder die Migration von innaten
Immunzellen zum Infektionsfokus im Peritoneum, noch die systemische Streuung der
Bakterien, noch die heftige systemische Inflammationsreaktion wurden durch die Treg-
Zusammenfassung
71
Depletion beeinflusst. Folglich war auch das Überleben Treg-depletierter Mäuse nicht
verändert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen damit das Konzept der „tuned suppression“: starke
inflammatorische Reize und hohe Antigenkonzentrationen, wie sie in der Sepsis beobachtet
werden, führen zu einem transienten Verlust der suppressorischen Eigenschaften von Tregs
und ermöglichen eine effektive anti-bakterialle Abwehr in der akuten Infektion.
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Anhang
79
8 Anhang:
Abbildung 19: CASP im verzögerten Depletionsansatz führte zur tendenziell veringerten Serum-
Konzentrationen von IL-9 aber nicht von IL-17
DT-vorbehandelte DEREG- und C57Bl/6- Mäuse als auch PBS-vorbehandelte DEREG-Tiere wurden einer
CASP-Operation unterzogen. 20 h später wurde das Blut gewonnen und die Konzentrationen von IL-9 und IL-17
im Serum bestimmt. CASP führte zu einer signifikanten Abnahme der IL-9-Spiegel, während die Konzentration
von IL-17 im Serum nur tendenziell erniedrigt war.
Dargestellt sind die Mediane jede Gruppe; n = 3-6 Tiere/ Gruppe; *: P < 0,05 **: P < 0,01
Anhang
80
CTLA-4 Expression im verzögerten Depletionsansatz
Abbildung 20: Kryostatschnitte der Milzen von PBS-vorbehandelten DEREGs und verzögert Treg-depletierten
Tieren wurden Zur Beurteilung der CTLA-4-Expression 20 h nach CASP-induzierter Sepsis
immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Gefärbt wurde mit aCD4-Alexa47 (blau), aFoxp3-Alexa488 und
purified aCTLA-4, der über einen biotinylierten aHamster-Ak und Streptavidin-TRITC (rot) angefärbt wurde.
Weiße Pfeile markieren CTLA-4+Foxp3- Teff-Zellen.
DEREG-PBS-CASP DEREG-DT-CASP
Anhang
81
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Biphasischer Verlauf der systemischen Immunantwort in der Sepsis. Adaptiert nach
Hotchkiss et al. [22] und Grimminger et al. [21]. ......................................................................................... 5
Abbildung 2: Mechanismen der Tregs zur Suppression von Effektor-T-Lymphozyten (Teff).
Modifiziert nach Vignali et al. [52, 58, 66] ................................................................................................... 12
Abbildung 3: Vollständige Depletion der CD4+ Foxp3+ regulatorischen T-Zellen nach zweimaliger
i.v. Applikation von Diphtherie-Toxin (DT) ................................................................................................ 38
Abbildung 4: Eine einmalige i.v. Applikation von Diphtherietoxin führt in den ersten 24 h zur
kontinuierlichen Abnahme der Treg-Population ..................................................................................... 39
Abbildung 5: CASP führte zu einer raschen Aktivierung von CD4+Foxp3+ Tregs und zu einem
erhöhten prozentualen Anteil dieser T-Zell-Subpopulation ................................................................ 41
Abbildung 6: Eine prophylaktische Treg-Depletion führte zu einer Verschlimmerung des
Krankheitsverlaufs aber nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP .............................. 42
Abbildung 7: Die verzögerte Treg-Depletion führt zu einem erschwerten Symptomverlauf, aber
nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP ................................................................................ 43
Abbildung 8: Treg-Depletion hat keinen Einfluss auf die systemische bakterielle Streuung in der
CASP ............................................................................................................................................................................ 45
Abbildung 9: Sowohl Gesamtzahl als auch Zusammensetzung der im Verlauf der CASP ins
Peritoneum wandernden Zellen ist durch die prophylaktische Treg-Depletion
unbeeinflusst .......................................................................................................................................................... 46
Abbildung 10: Die verzögerte Depletion der Tregs hat keinen Einfluss auf das Ausmaß der
bakteriellen Streuung in der CASP ................................................................................................................. 47
Abbildung 11: Kein Einfluss einer verzögerten Treg-Depletion auf die Zellzahl oder
Zusammensetzung des peritonealen Zellinfiltrats in der CASP ........................................................... 48
Abbildung 12: Einfluss der prophylaktischen Treg-Depletion auf die Aktivierung von Effektor-T-
Zellen und die Zytokinkonzentrationen im Serum unter basalen und septischen
Bedingungen ........................................................................................................................................................... 50
Abbildung 13: CASP führt zur Nivellierung der durch die Treg-Depletion erhöhten basalen Serum-
zytokinkonzentration .......................................................................................................................................... 51
Abbildung 14: Eine verzögerte Treg-Depletion führt innerhalb von 24 h zur Erhöhung des basalen
Aktivierungsgrades .............................................................................................................................................. 53
Abbildung 15: CASP führt zur Nivellierung der durch die Treg-Depletion erhöhten basalen Serum-
zytokinkonzentration im verzögerten Depletionsansatz ...................................................................... 54
Abbildung 16: Gestörte CTLA-4-Expression auf murinen Teff-Zellen nach verzögerter Treg-
Depletion und CASP .............................................................................................................................................. 55
Anhang
82
Abbildung 17: Kein Einfluss einer unmittelbaren Anwesenheit von DT im System auf CTLA-4
Expression auf Teff-Zellen ................................................................................................................................. 57
Abbildung 18: CASP führte zu veringerten Serum-Konzentrationen von IL-9 und IL-17 ..................... 59
Abbildung 19: CASP im verzögerten Depletionsansatz führte zur tendenziell veringerten Serum-
Konzentrationen von IL-9 aber nicht von IL-17 ......................................................................................... 79
Abbildung 20: Kryostatschnitte der Milzen von PBS-vorbehandelten DEREGs und verzögert Treg-
depletierten Tieren wurden Zur Beurteilung der CTLA-4-Expression 20 h nach CASP-
induzierter Sepsis immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Gefärbt wurde mit aCD4-
Alexa47 (blau), aFoxp3-Alexa488 und purified aCTLA-4, der über einen biotinylierten
aHamster-Ak und Streptavidin-TRITC (rot) angefärbt wurde. Weiße Pfeile markieren CTLA-
4+Foxp3- Teff-Zellen. ............................................................................................................................................ 80
Danksagung
83
Danksagung
Mein großer Dank gilt Frau Prof. Dr. Barbara M. Bröker für die freundliche Bereitstellung
dieses spannenden Forschungsthemas, aber noch mehr für ihre exzellente wissenschaftliche
Betreuung, die stetige Bereitschaft mit mir über die Daten zu diskutieren und nicht zuletzt
dafür, dass sie in mir die Leidenschaft für Forschung erweckte.
Mein herzlicher Dank richtet sich auch insbesondere an Christian Pötschke, ohne den diese
Arbeit so nicht möglich gewesen wäre, der mich in das wissenschaftliche Arbeiten einführte,
niemals müde wurde, meine zahlreichen Fragen zu beantworten und mich stets mit seinem
wissenschaftlichen Sachverstand bei der Interpretation der Ergebnisse unterstütze. Danke,
dass du mir beigebracht hast, dass Wissenschaft viel mehr ist als die bloße „Jagd nach
Signifikanzsternen“!
Ein großes Dankeschön gilt auch Dr. Katharina Cziupka, die neben ihrer Forschung und
Kliniktätigkeit stets die Zeit fand, die CASP-Operationen für mich durchzuführen. Danke für
die tolle Zusammenarbeit.
Ganz herzlich danken möchte ich auch Dodo Grumann, die mir bei den CBA-Analysen half,
mir einen Einblick in die Molekularbiologie und Mikrobiologie gab, mit mir „kleine grüne
Zellen sortierte“ und nicht selten ihre Freizeit opferte, um mit mir über das Manuskript zu
dieser Arbeit zu diskutieren. Ich danke dir, dass du mir geholfen hast den Blick für das
Wesentliche zu schärfen.
Ein großes Dankeschön geht an Oliver Nicolai und Julia van der Linde für stets kritische, aber
immer konstruktive Diskussionen und die viele Stunden, in denen Oli Agar-Platten schütteln
musste oder mit mir über das Manuskript zu dieser Arbeit diskutierte. Es war eine tolle Zeit
mit euch. Danke für den Spaß, den ihr in den Laboralltag brachtet.
Danksagung
84
Mein besonderer Dank gilt natürlich Erika Friebe, die immer mit Rat und Tat zur Seite stand,
auch im Angesicht von hunderten Agar-Platten nicht ihr Lächeln verlor und immer
aufzumuntern wusste, wenn etwas einfach nicht klappen wollte. Ich danke dir Erika, „es war
ein Traum“!
Frau Dr. Birte Holtfreter gilt mein Dank für die Unterstützung in Fragen der statistischen
Auswertung.
Unseren Kooperationspartnern Prof. Dr. Jochen Hühn und Prof. Dr. Tim Sparwasser danke
ich für die hilfreiche Diskussion bei der Gestaltung des Manuskripts und für die freundliche
Bereitstellung der DEREG-Mauslinie, ohne die diese Arbeit nicht möglich geworden wäre.
Und schließlich möchte ich mich von ganzem Herzen bei meiner Familie und meinem Partner
Erik bedanken, die mich stets unterstützt haben, mir Halt gaben und immer Verständnis
hatten, wenn die Freizeit mal knapp wurde.
Ich bin euch ewig dankbar, dass ihr mir auch in dunklen Zeiten ein Licht am Ende des
Tunnels wart.
Anhang
85
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden. Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Datum Unterschrift
Anhang
86
LEBENSLAUF
Matthias Rath
Persönliche Informationen
Familienstand: ledig
Nationalität: deutsch
Geburtstag: 13.02.1986
Geburtsort: Lübz
Ausbildung
Aug. 1992 – Juni 1996 Grundschule Lübz Lübz
Aug. 1996 – Juni 2005 Gymnasium Lübz Lübz
Abschluss: Abitur (Note: 1,0)
seit Okt. 2005 Studium der Humanmedizin an der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Sept. 2007 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
(Note: 1,5)
Nov. 2012 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
(Note: 1,5)
Promotion
Juni 2008 – Mai 2009 Promotionsstipendiat im Gerhard-Domagk-
Nachwuchsförderprogramm der Medizinischen Fakultät der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald zu dem Thema :
„Die Rolle Foxp3-positiver regulatorischer T-Zellen in der
murinen Sepsis“
(Betreuerin: Prof. Dr. med. Barbara M. Bröker)
Anhang
87
Juni 2008 – Juni 2010 Assoziiert im Graduiertenkolleg (GRK 840) der Deutschen
Forschungsgemeinschaft (DFG) „Wechselwirkungen zwischen
Erreger und Wirt bei generalisierten bakteriellen Infektionen“
_______________________ _______________________
Ort und Datum Unterschrift