Post on 06-Apr-2015
transcript
Physiologische und pathologische Rolle der kleinen GTP-bindenden Proteine
Zeitschalter der Zellen
Ligeti Erzsébet
Interzelluläre Verbindungen
lösliches Ligand Zelloberflächenligand
Interzelluläre Verbindungen
lösliches Ligand Zelloberflächenligand
Signalübertragunsprozesse in der Zelle
Bedenken:
Zellspezifizität
Affinität
Raum
Organisation der Signalübertragungsprozesse
im Raum
Bedenken:
Zellspezifizität Affinität Raum
Zeit
G Proteine:
GTP-Bindung
stabile, „steife” Konformation
Vetter and Wittinghofer Science 2001, 294. 1299.
Die terminale Phosphatgruppe des GTP stabilisiert das Protein
Überlappende Kristallstruktur von 4 kleinen G-Proteinen
G Proteine:
GTP-Bindung stabile, „steife” Konformation
GTP Hydrolysebewegliche Konformation
G Proteine: Zeitschalter
GTP-Bindung stabile, „steife” Konformation
GTP Hydrolysebewegliche Konformation
Zeitfaktor: Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse
GTP bindende Proteine
heterotrimer
(“gross”)
monomer
(“klein”)
GDP
GTP
smgGDP
smgGTP
smgGTP
smgGDP
GTP
GDP
GTPase Zyklus der G-Proteine
Ligand Bindung an GPCR
GAP (biol.Signal ) smgGTP smgGDP
GEF (biol.Signal )
Regulation der monomer G-Proteine
GAP = GTPase activating protein
GEF = Guanine nucleotide exchange factor
(aktiv) (inaktiv)
Subfamilien der monomeren GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
Subfamilien der monomeren GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
Proliferation
Transformation
Aktivierung des EGF-Rezeptors
Aktivierung des EGF-Rezeptors
László Buday (Chemie-Institut)
Wirkung des aktivierten Ras Proteins-1.
(Raf-Kinase)
Subfamilien der monomeren GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
Proliferation
Transformation
Bewegung
Formänderung
Transformation
Hall, 1998, Science, 279, 509-514.
Wirkung der Overexpression der G-Proteine der Rho-Familie
Rac
p67p67
p47
gp91
Rac
p67p67
p47
gp91
Untereinheiten der NADPH oxidase der Phagozyten (Phox)
e-
NADPH
O2
[Rho-kinase]
[Ca2+] = 10-8 M
[Ca2+] = 10-6 M
Summierung der Wirkung von MLCK und Rho-kinase
Subfamilien der monomeren GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
Proliferation
Transformation
Bewegung
Formänderung
Transformation
Membranrezirkulation
Schematische Darstellung der intrazellulären vesikulären Bewegungen
(vesicular traffic)
Prinzip der vesikularen Trennung (budding) und Fusion
Rolle des COPI Komplexes im vesikulären Transport von Golgi zum ER
Subfamilien der monomeren GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
Proliferation
Transformation
Bewegung
Formänderung
Transformation
Membranrezirkulation
Nuklearer Transport
Chromosomen bewegungen
Clarke and Zhang, 2001, TiCB, 11, 366-371.
Rolle von Ran in verschiedenen Phasen des Zellzyklus
Subfamilien der kleinen GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
GAP 25 70 52 27 1
GEF 50-60
Ras und Tumore
Point mutations are frequently detected in the ras family of protooncogenes (K-ras, H-ras, and N-ras).
It has been estimated that as many as 15% to 20% of unselected human tumors may contain a ras mutation.
Studies have found K-ras mutations in about 30% of lung adenocarcinomas, 50% of colon carcinomas, and 90% of carcinomas of the pancreas.
N-ras mutations are preferentially found in hematologic malignancies, with up to a 25% incidence in acute myeloid leukemias and myelodysplastic syndromes.
The majority of thyroid carcinomas have been found to have ras mutations distributed among K-ras, H-ras, and N-ras, without preference for a single ras family member but showing an association with the follicular type of differentiated thyroid carcinomas
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15
min
[32
P]G
TP
bo
un
d
Bedeutung der Rate der GTP-Hydrolyse
Rac
V12Rac
Bedeutung der Rate der GTP-Hydrolyse
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0 5 10 15
min
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P]G
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Rac
V12Rac
+ GAP
+ GAP
Bedeutung der Rate der GTP-Hydrolyse
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0 5 10 15
min
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P]G
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Rac
V12Rac
+ GAP
+ GAP
Subfamilien der kleinen GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
GAP 25 70 52 27 1
Rac
p67p67
p47
gp91
Rac
p67p67
p47
gp91
Untereinheiten der NADPH oxidase der Phagozyten (Phox)
e-
NADPH
O2
0
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200
300
400
0,1 1 10 100
Nucleotide concentration (µM)
O2.-
prod
ucti
on (
nmol
x m
in-1x
mg-1
)
GTP
GTP + F
GTP[S]
Hemmung des GAPs erhöht die Phox-Aktivität
Bcr
p190 RhoGAP
p50 RhoGAP
mem
bran
e
cyto
sol
rat b
rain
extra
ct
Rac-GAP in neutrophilen Granulozyten
Geiszt et al.
BJ 2001
Folgen der Abwesenheit von Bcr GAP
Gewichtänderung nach LPS Behandlung
Darmnekrose
Voncken et al. Cell, 1995
Regulation des regulierenden Proteins?
Domainstruktur der Rho/Rac GAP
GTPase 4 x FF GAP
p190RhoGAP
PKCSrc
Abwesenheit (KO egér):
Störung der Entwicklung des ZNS
Störung der Differentiation der Fettzellen
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
1 10 100 1000
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
1 10 100
Relative amount of p190Rho-GAP
Bou
nd 32
P-G
TP
(%
)
Bou
nd 32
P-G
TP
(%
)
PS ändert die Substratspezifizität von p190RhoGAP
RhoGAP RacGAP
Rho Rac
+ PS
Ligeti et al. JBC 2004.
geschlossen
Interaktion mit prenyliertem Rac
geöffnet
Modell der Interaktion pRac-p50GAP
Moskwa et al. JBC 2005
189CAAXRAC 189CRAC
Prenyl-transferase
Posttranslationelle Modifizierung von G-Proteinen
Ins-R
GAP
monomere G-Proteine
ZEIT Faktor der Signalübertragung
Zusammenfassung
p50RhoGAP
Sok sejt kifejezi
Granulocitákban nagy mennyiségben
1 439
Sec14 GAPPP
0
0.10.2
0.3
0.40.5
0.6
0.7
0.80.9
1
0 min 5 min 10 min 15 min
Bou
nd 3
2P-G
TP (%
)
npRac
GAP-FL
GAP49
GAP198
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 min 5 min 10 min 15 minB
ou
nd
32P
-GT
P (
%)
p50RhoGAP érzékeny a preniláltsági állapotra
nem-prenilált Rac prenilált Rac
Moskwa et al. JBC, 2005
Rac
p67p47
gp91
GAP1
GAP2
Hipotézis: Különböző reakciókban különböző GAPok szabályozzák ugyanazt a G-fehérjét
Rac
Moskwa et al. Biochemistry 2002.
Bigay et al. Nature 2003. 426. 563
Az ARF1-GAP szabályozásának modellje
A p50RhoGAP fúziós fehérjeként kifejezett fragmensei
1 439
49
87
121
169
198
211
Sec14 GAPPP
GAP Rac·GTP Rac·GDP
GEF
RhoGDI·Rac·GDP
A Rac GTPáz szabályozása
GAP = GTPase activating protein
GEF = Guanine nucleotide exchange factor
GDI = Guanine nucleotide dissociation inhibitor
smgGTP
smgGDP
GTP
GDP
GAP
A G fehérjék GTPáz ciklusa
Target,RGS GEF
Ligand kötés GPCR-n
Molecular Cell Biology 20. Cell-to-Cell Signaling: Hormones and Receptors 20.4. Receptor Tyrosine Kinases and Ras
Aktivierung des EGF-Rezeptors-1.
Molecular Cell Biology 20. Cell-to-Cell Signaling: Hormones and Receptors 20.4. Receptor Tyrosine Kinases and Ras
Aktivierung des EGF-Rezeptors – 2.
Subfamilien der monomeren GTPasen
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
proliferáció
transzformáció
mozgás
alakváltozás
transzformáció
membrán
körforgás
magmembrán
kromoszóma mozgás