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Chlamydiendiagnostik mit der PCR:
Methodische Aspekte, vergleichendeUntersuchungen und Ergebnisse bei
Rindern
Wolfgang Gaede, Susanne Kenklies und Wolfgang Peter
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich 4: Veterinäruntersuchungen und -epidemiologie in Stendal
Ausgangspunkt:Chlamydien als Problemkeim in derRinderhaltung und Zoonose-Erreger
• Erkrankungen von Rindern in Großviehhaltungen mitangenommener Beteiligung von Chlamydien(Fortpflanzungsstörungen, Bronchopneumonien,Mastitiden)
• Erhöhte Milchzellzahl in Beständen mit„Chlamydienproblemen“
• Forderung der Landwirte nach Einsatz bestands-spezifischer bzw. kommerzieller Vakzine
• Erkrankungen bei Tierpflegern mit Chlamydien-Titern• Ergebnisse des Milchmonitoring von
Sammelmilch/Rohmilch
Der Konflikt:
Wittenbrink et al.,1988:• Kulturelle und morphologische Untersuchung• 12 von 15 Rinder (=80%) positive Chlamydienisolierung
aus Vaginalschleimhaut ohne entzündlicheVeränderungen
Sting, 1997:Dank verbesserter Diagnostik mit Antigen-ELISA :• 33 % der Genitaltupfer und• 79 % der Nachgeburten und Feten positiv für Chlamydien
Zielstellung für die Diagnostik vonChlamydieninfektionen beim Rind :
Unmittelbar: Sicherer Antigen-Nachweis• Sensitivität für verschiedene Untersuchungsmaterialien• Spezifität (für Chlamydia und Chlamydophila sp.)• ggf. Spezies-Differenzierung
Langfristig: Aussagen zur Kausalität• Nachweis von Virulenzmarkern• Quantitative Bewertung
Das diagnostische Repertoire:
Serologie (ELISA, KBR)
Antigen-ELISA:• bis 2001: IDEIA Chlamydien-Antigen (DAKO)• ab 2002: PCE Chlamydia Screening und PCE-Blockingtest (DAKO)
PCR:• OMP-Gen (Kaltenböck et al. 1997 und Schiller et al. 1997)• 23SrRNA (Everett et al. 1999), derzeit Modifikation zur Verbesserung der Robustheit in Validierung• (16S/23S-Interspacer-Region - Hotzel 2002, pers. Mitteilung)
Kulturelle Anzüchtung (BGM, Brutei)
Chlamydiendiagnostik mit der PCR:
Methodische Aspekte, vergleichendeUntersuchungen und Ergebnisse bei
Rindern
Wolfgang Gaede, Susanne Kenklies und Wolfgang Peter
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich 4: Veterinäruntersuchungen und -epidemiologie in Stendal
Epidemiologische Erhebungen zu Chlamydieninfektionenin Rinderbeständen Sachsen-Anhalts
Epidemiologische Erhebungen zu Chlamydieninfektionenin Rinderbeständen Sachsen-Anhalts
Chlamydia-Antigen-Nachweis 2002
Untersuchungsumfang:
? 432 Proben von
? 102 Beständen aus
? 20 Landkreisen
92%
8%
0%
negativ
PCR positiv
ELISA positiv
Landesübersicht
64%
5%
31%
negativ
PCR positiv
ELISA positiv
Chlamydia-Antigen-Nachweis 2001
Untersuchungsumfang:
? 404 Proben von
? 50 Beständen aus
? 16 Landkreisen
Landesübersicht
Methodenvergleich mit klinischemMaterial von Rindern aus 2001:
IDEIA-ELISA Chomp-PCR AnzüchtungMaterial n
pos neg pos neg pos neg
Organe 61 18 43 6 49 1 21Tupfer 250 122 95 16 229 2 186Milch 20 5 15 0 5 0 0
Summe 155 153 19 283 3 207ges. 308 302 300
%pos. 50,3 6,3 1,0(nach Peter, Gaede, Borgwardt, 2002)
Schlussfolgerung: Wahrscheinlich unspezifische Reaktionen imAntigen-ELISA bei Rinderproben (nicht bei Geflügel/Schaf)
Vergleiche im Rahmen einesImpfversuches (Chlamyvax FQ):
Anzüchtung PCE-ELISA PCE-Blocking(BGM) (Screening) (Bestätigung)
gesamt 312 12 312 303 142positiv 8 233 144
positiv (%) 3% 75% 48%fraglich 5negativ 299 12 79 159 142
negativ (%) 96% 100% 25% 52% 100%
Vaginaltupfter Chomp-PCR IDEIA-ELISA
Vorbericht: 3 Betriebe mit Reproduktionsstörungen und klinischer Verdachtsdiagnose Chlamydieninfektion
Nach Vakzinierung: - Serokonversion im ELISA - klinische Besserung für ca. 6-9 Monate
Ausscheidungsversuch(Applikation von Cp.abortus-LV):
Ablauf: - 1 Milchviehbetriebe ohne Verdacht auf Chlamydieninfektion (klinisch und KBR)
- einmalige Vakzinierung, Kontrolle Erregerausscheidung in Versuchs- und Kontrollgruppe
Ergebnis: - keine Ausscheidung des Impfstammes - keine signifikante Beeinflussung der ubiqitären Chlamydien
PCE-ELISA PCE-Blocking Sequenzierung(Screening) (Bestätigung) (BFAV Jena)
Vaginal- und Augentupfter
gesamt 176 176 176 7positiv 46 52* 7 1 23 x Cp. pecorum
positiv (%) 26% 30% 4% 0,6% 9 x Cp. psiitaci
Kotproben
gesamt 72 72positiv 38 41* 17 x Cp. pecorum
positiv (%) 52,8 56,9 14 x Cp. psiitaci
Chomp-PCR Real Time PCR
Vergleichende Untersuchungenan klin. und pathol. Proben 2003
Erläuterungen:*) 39/41 positiv: fehlende Übereinstimmung bei 8 Proben (1 Eihaut, 7 Tupfer), diese sind kulturell und im Antigen-ELISA ausnahmslos negativ
AnzüchtungScreening Bestätigung (BGM)
davonpositiv 39* 41* 42** 3*** 5****
PCE-Antigen-ELISA
263 Proben von Rindern
Chomp-PCR PCR-Sonde
**) 41 positiv: davon nur 13 Proben positiv in der PCR und 3 Proben positiv in der kulturellen Anzüchtung (ergo: Unspezifität)
***) 3 positiv: davon 2 Proben positiv in der kulturellen Anzüchtung, und alle 3 Proben positiv in der PCR
Vergleichende Untersuchungenan klin. und pathol. Proben 2003
****) Anzüchtung: insgesamt 44 PCR-positive oder -verdächtige Proben
davon 5 x positiv: - 3 x pos. und 2 x neg. in Screening-ELISA
- 2 x pos. und 3 x neg. in Bestätigungstest
AnzüchtungScreening Bestätigung (BGM)
davonpositiv 39* 41* 42** 3*** 5****
PCE-Antigen-ELISA
263 Proben von Rindern
Chomp-PCR PCR-Sonde
unter Bestätigungs-ELISA-negativen Proben sind: Cl 90: 8 Tupfer pos. PCR, 6 x pos. im Screening-ELISA,
2 x pos. in Anzüchtung, stallspez.Vakzine in Gießen in Arbeit
Untersuchung von Verdachtsprobenvon Rindern mit der PCR
13(5,2% )
249 26(4,5% )
601
57(6,7% )
849
31(9,5% )
366
0
200
400
600
800
1000
2000 2001 2002 August 03
positive PCR Summe PCR
Untersuchte Betriebe:- 2002: 135 Betriebe, davon 29 (21,5%) mit Reagenten- 2003: 31 „ „ 10 (32,3%) „ „
*) weitere Ergebnisse:
Chomp-PCR positivAntigen-ELISA negativ
Sequenzanalyse im BgVV / BFAV Jena: C. pecorum
Nachweis von Chlamydien mit derReal Time-PCR in Abortmaterial
*) weitere Ergebnisse:
Chomp-PCR positiv (Cp.psittaci)Antigen-ELISA negativ
Anzüchtung 2 x positiv, davon Vakzine in Herstellung
Nachweis von Chlamydien mit derReal Time-PCR in Zervixtupfern
ZusammenfassungBewertung diagnostischer Verfahren zum Chlamydien-Screening:• PCR: - Chomp-PCR und Real Time-PCR verfügen über vergleichbare und für die Falldiagnostik hinreichende Sensitivität - Vorteile Real Time-PCR: Semiquantitative Auswertung, weniger arbeitsaufwendig, geringeres Kontaminationsrisiko - Vorteile Chomp-PCR: Speziesdifferenzierung möglich aber gegenwärtig ohne Belang für klinische Wertung
• Antigen-ELISA (PCE) als Screening- und Bestätigungstest im Hinblick auf Sensitivität völlig unzureichend - Spezifität des Screeningtests ebenfalls unzureichend
Chlamydien als Infektionserreger beim Rind: - Abgrenzung ubiquitärer Schleimhautbesiedlung / Pathogen weiter unklar - keine „Rinderseuche“, aber einzelne Bestandserkrankungen möglich
Die Sorgen mancher Rinderhalter
© Zwickmühle Magdeburg: Unter allen Zipfeln ist Ruh
Herzlichen Dank
• Dr. Helmut Hotzel und Dr. Konrad Sachse;BFAV Jena
• Frau Uta Rahn, Frau Kerstin Schenk; Stendal