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transcript
Lokalisation und Aktivierung von
ADAM-Proteasen im Kontext der
Fas-Ligand-Proteolyse in T-Zellen
DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von Henriette Ebsen
Kiel
2014
Erster Gutachter: Prof. Dr. Ottmar Janßen Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Dr. Thomas C. G. Bosch Tag der mündlichen Prüfung: 14.08.2014 Zum Druck genehmigt: 14.08.2014
gez. Prof. Dr. Wolfgang J. Duschl, Dekan
Inhaltsverzeichnis
I
I. Inhaltsverzeichnis
I. Inhaltsverzeichnis I
II. Abkürzungsverzeichnis V
1. Einleitung 1
1.1 Fas-Ligand .........................................................................................................1
1.1.1 Struktur des Fas-Liganden .................................................................................1
1.1.2 Funktionen des Fas-Liganden ............................................................................3
1.1.3 Expression des Fas-Liganden ............................................................................5
1.1.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der Expression des Fas-Liganden ........6
1.1.4.1 Transkriptionale Regulation des Fas-Liganden ...................................................6
1.1.4.2 Posttranslationale Modifikationen des Fas-Liganden ..........................................6
1.2 A Disintegrin And Metalloproteases (ADAMs) .................................................. 10
1.2.1 Struktur von ADAM10 ....................................................................................... 11
1.2.2 Funktionen von ADAM10 .................................................................................. 13
1.2.3 Expression von ADAM10 .................................................................................. 13
1.2.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der ADAM10-Aktivität ......................... 14
1.2.4.1 Transkriptionale Regulation von ADAM10 ........................................................ 14
1.2.4.2 Posttranslationale Modifikationen von ADAM10 ............................................... 15
1.2.5 Implikationen von ADAM-Proteasen bei bestimmten Krankheitsbildern ............ 20
2. Fragestellung 22
3. Material 24
3.1 Material für die Zellbiologie ............................................................................... 24
3.1.1 Zellkultur........................................................................................................... 24
3.1.2 Bakterien und Phagen ...................................................................................... 24
3.1.3 Medien und Puffer ............................................................................................ 25
3.1.3.1 Zellkulturmedien/Zusätze für die Zellkultur ....................................................... 25
3.1.3.2 Kalzium-Phosphat-Transfektion ........................................................................ 25
3.1.3.3 Konfokale Mikroskopie ..................................................................................... 26
3.1.3.4 Durchflusszytometrie ........................................................................................ 26
3.1.3.5 Antikörper ......................................................................................................... 27
3.1.4 Weitere Reagenzien und Inhibitoren ................................................................. 28
3.1.5 Verwendete Kits für die Zellbiologie .................................................................. 28
Inhaltsverzeichnis
II
3.2 Material für molekularbiologische Experimente................................................. 28
3.2.1 Vektoren und Konstrukte .................................................................................. 28
3.2.2 Primer .............................................................................................................. 29
3.2.3 siRNAs ............................................................................................................. 29
3.2.4 Enzyme für die Molekularbiologie ..................................................................... 29
3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................. 30
3.2.6 Puffer und weitere Reagenzien ........................................................................ 30
3.2.7 Material für das Screening interagierender SH3-Domänen ............................... 30
3.2.8 Kits für die Molekularbiologie ............................................................................ 31
3.3 Material für biochemische Analysen ................................................................. 32
3.3.1 Puffer und Reagenzien ..................................................................................... 32
3.3.1.1 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen .......................................................... 32
3.3.1.2 Lysieren von Zellen .......................................................................................... 32
3.3.1.3 Proteinbestimmung .......................................................................................... 32
3.3.1.4 Pull-Down/Immunpräzipitation .......................................................................... 32
3.3.1.5 SDS-PAGE: Protean II-System (Bio-Rad) ........................................................ 33
3.3.1.6 SDS-PAGE: NuPAGE-System (Invitrogen) ....................................................... 33
3.3.1.7 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen ...................... 34
3.3.1.8 Western Blot ..................................................................................................... 34
3.3.2 GST-Fusionsproteine ....................................................................................... 35
3.3.3 Antikörper ......................................................................................................... 36
3.3.4 Kits für die Biochemie ....................................................................................... 37
3.4 Weitere Materialien .......................................................................................... 37
3.5 Geräte .............................................................................................................. 38
4. Methoden ........................................................................................................ 40
4.1 Zellbiologische Methoden ................................................................................. 40
4.1.1 Zellkultur........................................................................................................... 40
4.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität.......................................................... 40
4.1.3 Kryokonservierung von Zellen .......................................................................... 40
4.1.4 Transfektion von Zellen .................................................................................... 41
4.1.4.1 Kalzium-Phosphat-Transfektion ........................................................................ 41
4.1.4.2 Nukleofektion ................................................................................................... 41
4.1.5 Immunfluoreszenzanalysen .............................................................................. 41
4.1.5.1 Konfokale Mikroskopie ..................................................................................... 41
4.1.5.2 Durchflusszytometrie ........................................................................................ 42
4.1.5.2.1 Detektion von Zelloberflächenmolekülen .......................................................... 42
4.1.5.2.2 Zelltodanalyse mittels Propidiumiodidfärbung ................................................... 43
4.1.6 Stimulation von Zellen ...................................................................................... 43
Inhaltsverzeichnis
III
4.2 Molekularbiologische Methoden ....................................................................... 44
4.2.1 RNA-Isolierung ................................................................................................. 44
4.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).................................................................... 44
4.2.2.1 RT-PCR............................................................................................................ 44
4.2.2.2 Konventionelle PCR ......................................................................................... 45
4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................. 46
4.2.4 Restriktionsverdau ............................................................................................ 46
4.2.5 Ligation ............................................................................................................ 46
4.2.6 Transformation hitzeschockkompetenter Bakterien .......................................... 47
4.2.7 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien .................................................. 47
4.2.8 Sequenzierung und Sequenzierungsanalyse .................................................... 48
4.2.9 Glycerolstocks .................................................................................................. 48
4.2.10 Identifizierung interagierender SH3-Domänen mittels Phagenbibliothek ........... 48
4.3 Biochemische Methoden .................................................................................. 50
4.3.1 Expression und Aufreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine .................. 50
4.3.2 Herstellung von Zelllysaten und Bestimmung des Proteingehalts ..................... 51
4.3.3 Detektion von löslichem FasL in Zellkulturüberständen (ELISA) ....................... 51
4.3.4 Pull-Down mit rekombinanten GST-Fusionsproteinen ...................................... 51
4.3.5 Immunpräzipitation ........................................................................................... 52
4.3.6 Isolation sekretorischer Granula ....................................................................... 52
4.3.7 Isolation Detergenz-resistenter Membranen (DRMs) ........................................ 52
4.3.8 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ......................................... 53
4.3.9 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen ...................... 54
4.3.10 Western Blot ..................................................................................................... 54
5. Ergebnisse 55
5.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden ........................................ 55
5.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10 ........................................... 55
5.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter Proteolyse ........................................................................................................ 62
5.1.3 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL ............. 66
5.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen ............................... 75
5.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen ........................................................ 75
5.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation ........................................ 78
5.2.3 Einfluss der Cholesteroldepletion und Inhibierung posttranslationaler Modifikationen auf die CD3/CD28-vermittelte Proteolyse des FasL .................. 83
5.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10 .......................... 94
5.3.1 Identifizierte präzipitierte SH3-Domänen einer Phagenbibliothek ..................... 94
5.3.2 Verifizierung potentieller Interaktionen .............................................................. 98
Inhaltsverzeichnis
IV
6. Diskussion 108
6.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden ...................................... 108
6.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10 ......................................... 108
6.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter Proteolyse ...................................................................................................... 114
6.1.3 Intramembrane Proteolyse des FasL durch SPPL2a ...................................... 115
6.1.4 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL ........... 115
6.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen ............................. 117
6.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen ...................................................... 117
6.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation ...................................... 119
6.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10 ........................ 122
6.4 Proteolyse als posttranslationale Modifikation kontrolliert die Expression des FasL ........................................................................................................ 129
7. Zusammenfassung 131
8. Summary 133
9. Literaturverzeichnis 135
10. Anhang 152
10.1 Publikationsliste .............................................................................................. 152
10.2 Tabelle A1 ...................................................................................................... 154
10.3 Abbildungen A1-3 ........................................................................................... 155
10.4 Danksagung ................................................................................................... 157
10.5 Wissenschaftlicher Werdegang ...................................................................... 158
10.6 Eidesstattliche Erklärung ................................................................................ 159
Inhaltsverzeichnis
V
II. Abkürzungsverzeichnis
2BP 2-Brompalmitat 2HMA 2-Hydroxymyristylsäure Abb. Abbildung ADAM A Disintegrin And Metalloprotease AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfluorid AICD activation-induced cell death AK Antikörper ALPS autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BAR Bin/Amphiphysin/Rvs BSA bovine serum albumin, Rinderalbumin CAU Christian-Albrechts-Universität zu Kiel CD cluster of differentiation cdc42 cell division cycle protein 42 cDNA complementary DNA CKI Casein-Kinase-I CO2 Kohlenstoffdioxid CTF C-terminales Fragment CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte associated protein-4 DAPI 4′,6-Diamidin-2-Phenylindol DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate E. coli Escherichia coli EBV Epstein-Barr Virus ECL enhanced chemoluminescence light EDTA Ethylendiamintetraacetat EGF epidermal growth factor EGFR epidermal growth factor receptor EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-
tetraessigsäure e.H. eigene Herstellung ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay ER Endoplasmatisches Retikulum FACS Fluorescence activated cell sorting FasL Fas-Ligand FCH Fes/CIP4 homology FCS Fetal calf serum, fötales Kälberserum FWP FACS-Waschpuffer g gravity (Erdbeschleunigung: 9,81 m/s2) GADS Grb2-related adaptor downstream of Shc GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GEF guanine-nucleotide exchange factor gld generalized lymphoproliferative disease Grb2 growth factor binding protein 2 GST Glutathion-S-Transferase h Stunde HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-
ethansulfonsäure
Inhaltsverzeichnis
VI
HRP Horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) ICD intracellular domain Ig Immunglobulin IL Interleukin IP Immunpräzipitation IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid k.A. keine Angabe kDa Kilodalton LAMP Lysosomen-assoziiertes Membranprotein LAT linker for activation of T cells Lck lymphocyte-specific protein tyrosine kinase lpr lymphoproliferation LSM Laser-Scanning-Mikroskop MHC major histocompatibility complex min Minute MICA/B MHC-class-I-related chain A/B MMP Matrix-Metalloprotease mRNA messenger ribonucleic acid MβCD Methyl-β-Cyclodextrin NEB New England Biolabs NK-Zellen Natürliche Killerzellen NP-40 Nonidet P-40 NTF N-terminales Fragment PACSIN Protein kinase C and casein kinase substrate in
neurons protein PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBMC Peripheral blood mononuclear cell PBS Phosphate-buffered saline PCH pombe cdc15 homology PCR polymerase chain reaction PD Pull-Down PE Phycoerythrin PFA Paraformaldehyd PHA Phytohämagglutinin PHA-Blasten Phytohämagglutinin-aktivierte T-Zell-Blasten PI Propidiumiodid PIPES Piperazin-N,N'-bis(2-Ethansulfonsäure) PKC Proteinkinase C PP1 1-(1,1-Dimethylethyl)-3-(4-Methylphenyl)-1H-
Pyrazol[3,4-d]Pyrimidin-4-Amin PRD Prolin-reiche Domäne pTyr Phosphotyrosin rIL-2 rekombinantes IL-2 RNA ribonucleic acid rpm rounds per minutes RPMI Roswell Park Memorial Institute RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR SAP Shrimp alkaline phosphatase SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese sek Sekunde sFasL soluble Fas ligand (löslicher Fas-Ligand) SH2/3 Src homology 2/3 siRNA small interfering RNA SLP-76 SH2-domain-containing leukocyte protein of 76 kDa
Inhaltsverzeichnis
VII
SNX Sorting Nexin SPPL Signal Peptide Peptidase-like TAE Tris/Acetat/EDTA TBS Tris-buffered saline TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin TGF transforming growth factor TGN trans-Golgi-Netzwerk THD TNF-Homologie-Domäne TNF tumor necrosis factor TNFR TNF-Rezeptor TNFRSF6 TNFR superfamily member 6 TNFSF6 TNF ligand superfamily member 6 TPA Tetradecanoylphorbolacetat Tris Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan TZR T-Zellrezeptor UK S-H Universitätsklinikum Schleswig-Holstein UV Ultraviolett V Volt v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen WB Western Blot
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Fas-Ligand
Der Fas-Ligand (FasL, CD95L, Apo-1L, CD178, TNFSF6) nimmt durch seine
Eigenschaft, in Fas-exprimierenden Zellen Apoptose zu induzieren, eine wichtige
regulatorische Rolle innerhalb des Immunsystems ein. Er ist unter anderem an der
zytotoxischen Effektorfunktion von T- und NK-Zellen zur Elimierung infizierter Zellen,
der Beendigung einer Immunantwort nach Aktivierung des adaptiven Immunsystems
(activation-induced cell death, AICD) sowie der Ausbildung immunpreviligierter
Gewebe beteiligt. Verschiedene Tumorzellen exprimieren den FasL auf ihrer
Oberfläche und können dadurch aktivierte Tumor-infiltrierende Fas-positive
Lymphozyten eliminieren. Die Oberflächenexpression des FasL muss strikt reguliert
werden, da sein Rezeptor Fas (CD95, Apo-1, TNFRSF6) auf verschiedensten
Zelltypen exprimiert wird. Dies erfolgt auf verschiedenen Ebenen: neben einer
transkriptionalen Basiskontrolle erfolgt die Regulation auch auf posttranslationaler
Ebene, z.B. durch Speicherung des FasL in sekretorischen Lysosomen, durch eine
aktivierungsabhängige Mobilisierung zur Zelloberfläche und durch proteolytische
Prozessierung zur Reduktion der Oberflächenexpression.
1.1.1 Struktur des Fas-Liganden
Der FasL ist ein Typ-II-Transmembranprotein der TNF-Superfamilie und ist aus
verschiedenen funktionellen Domänen aufgebaut (Abbildung 1.1). Humaner FasL
besteht aus 281 Aminosäuren, muriner FasL aus 279 Aminosäuren (Suda et al.,
1993; Takahashi et al., 1994). Das FasL-Gen liegt hoch konserviert vor: humaner
und muriner FasL weisen eine Sequenzhomologie von 76,9% auf (Takahashi et al.,
1994). Der N-terminale intrazelluläre Teil enthält zwei Casein-Kinase-I-Substrat-
Motive (CKI-Motive), denen eine wichtige Funktion im Rahmen einer reversen
Signaltransduktion zugewiesen wurde (Watts et al., 1999; Sun et al., 2007), sowie
eine Prolin-reiche Domäne (PRD, AS 37-70) zur Interaktion mit Proteinen mit SH3-
(Src homology 3-) oder WW-Domänen (Wenzel et al., 2001, Ghadimi et al., 2002;
Janssen et al., 2003; Lettau et al., 2008). Der zytosolische Teil des FasL beinhaltet
außerdem drei mögliche Tyrosinphosphorylierungsstellen (AS Y7, Y9, Y13) (Zuccato
et al., 2007). Nach der Transmembranregion (AS 81-102) folgt eine Domäne zur
Selbstaggregation (AS 137-183). Der FasL bildet wie auch andere Mitglieder der
Einleitung
2
TNF-Superfamilie funktionell aktive Trimere (Tanaka et al., 1995; Tang et al., 1995).
Die TNF-Homologie-Domäne (THD, AS 184-275) vermittelt mit der C-terminalen
Rezeptorbindungsregion die Bindung des Liganden an seinen Rezeptor Fas. In Nähe
der Transmembranregion befinden sich potentielle Spaltstellen für Metalloproteasen
(hFasL S126/127L, K129/130Q (Schneider et al., 1998); mFasL K127/128Q (Tanaka
et al., 1998)). Hier wird der FasL proteolytisch gespalten und ein N-terminales
Fragment (NTF) generiert, welches in der Membran verankert bleibt, sowie ein
lösliches Zytokin (soluble FasL, sFasL) (Schulte et al., 2007), welches als Antagonist
des membrangebundenen Liganden angesehen wird (Schneider et al., 1998). Das N-
terminale Fragment kann innerhalb der Transmembranregion von der I-CLiP
(intramembrane cleaving protease) SPPL2a gespalten werden (hFasL L81/82C;
mFasL L79/80W) und die intrazelluläre Domäne (intracellular domain, ICD) wird in
das Zellinnere freigesetzt (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007).
Abb. 1.1: Schematischer Aufbau des Fas-Liganden. N-terminal befinden sich zwei Casein-Kinase-I-Substrat-Motive. Die Prolin-reiche Domäne dient der Protein-Protein-Interaktion mit SH3-/WW-Domänen. Nach der Transmembrandomäne folgt Selbstaggregationsdomäne für die Multimerisierung. Für die Bindung des FasL an seinen Rezeptor Fas wird die TNF-Homologie-Domäne benötigt. Am C-terminalen Ende liegt die Rezeptorbindungsstelle. Bei Proteolyse des FasL durch Metalloproteasen entsteht ein lösliches extrazelluläres Fragment (soluble FasL, sFasL) und ein membranständiges N-terminales Fragment (NTF). Bei weiterer Prozessierung durch innerhalb der Membran schneidende Proteasen wird die intrazelluläre Domäne (intracellular domain, ICD) ins Zytosol entlassen. Abkürzungen: I-CLiPs: intramembrane cleaving protease; TNF: tumor necrosis factor.
Einleitung
3
1.1.2 Funktionen des Fas-Liganden
Der FasL erfüllt durch die Induktion von Apoptose über die Ligation seines Rezeptors
Fas verschiedene Aufgaben innerhalb des Immunsystems (Abbildung 1.2). Als
zytotoxisches Effektormolekül auf T- und NK-Zellen kann er in Fas-exprimierenden
infizierten Zielzellen Apoptose einleiten. Dies stellt eine Ergänzung der klassischen
Zytotoxizität über Granzym B und Perforin dar (Rouvier et al., 1993; Trambas und
Griffiths, 2003). Weiterhin spielt der FasL eine wichtige Rolle beim
aktivierungsinduzierten Zelltod (activation-induced cell death, AICD). Während naive
T-Zellen resistent gegenüber Fas-vermittelter Apoptose sind (Green et al., 1992),
exprimieren aktivierte T-Zellen steigende Level an Fas und FasL und werden sensitiv
für Fas/FasL-induzierte Apoptose (Refaeli et al., 1998; Janssen et al., 2000a; Green
et al., 2003). AICD resultiert in der Eliminierung aktivierter T-Zellen durch erneute
Stimulation des T-Zellrezeptors (TZR) und dient der Beendigung einer Immunantwort
und Erhaltung der peripheren Toleranz durch Beseitigung autoreaktiver T-Zellen (Shi
et al., 1990; Dhein et al., 1995; Green et al., 2003; Singer und Abbas, 1994; Zhang et
al., 2004). Eine weitere Rolle als zytotoxisches Effektormolekül wird dem FasL auch
bei der negativen Selektion während der Reifung von Lymphozyten im Thymus
zugesprochen (Kishimoto et al., 1998). Ist die Fas/FasL-induzierte Apoptose durch
Mutationen beeinträchtigt, kann es durch eine gestörte T-Zellhomöostase zur
Entstehung von Autoimmunitäten mit Lymphadenopathien, Splenomegalien oder
Lupus erythematodes kommen (Rieux-Laucat et al., 2003; Fisher et al., 1995; Wu et
al., 1996; Magerus-Chatinet et al., 2013). Eine natürlich vorkommende Maus-Mutante
(gld, generalized lymphoproliferative disease) weist ähnliche pathologische
Veränderungen auf wie Patienten mit einem autoimmunen lymphoproliferativen
Syndrom (ALPS).
Eine weitere Funktion des FasL ist der Schutz immunpreviligierter Regionen, in
denen immunologische Immunantworten stark reduziert sind. Es gibt verschiedene
Mechanismen zum Aufbau derartiger Barrieren: die Expression von MHC-Molekülen
ist reduziert, es bildet sich ein inhibitorisches Zytokinmilieu (z.B. IL-10, TGF)
und/oder entsprechende Gewebe (z.B. Cornea, Testis, Gehirn) exprimieren den FasL
zur Beseitigung infiltrierender Fas-tragender Lymphozyten (Griffith et al., 1995;
Bellgrau et al., 1995; Niederkorn, 2006). Eine „negative“ Rolle wird dem FasL bei der
Umgehung des Immunsystems von Tumorzellen zugeschrieben. Bei der
sogenannten „Tumor Counterattack“ exprimieren Tumorzellen FasL auf ihrer
Einleitung
4
Oberfläche bzw. sekretieren den FasL mit speziellen Vesikeln und beseitigen oder
hemmen einwandernde Lymphozyten, um ihrer Eliminierung zu entgehen (O’Connell
et al., 1996; Andreola et al., 2002). Die Bedeutung des FasL auf Tumorzellen wird
jedoch durchaus kontrovers diskutiert, da die Expression des FasL auch mit pro-
inflammatorischen, anti-apoptotischen Effekten assoziiert wurde (Igney und
Krammer, 2005).
Abb. 1.2: Funktionen und Regulationsmechanismen des Fas-Liganden. Die Bindung des FasL an seinen Rezeptor führt zur Induktion von Apoptose und trägt damit zur Eliminierung von virusinfizierten Zellen und Tumorzellen sowie dem aktivierungsinduzierten Zelltod (activation-induced cell death, AICD) zur Erhaltung der Immunhomöostase bei. Außerdem spielt er bei der T-Zellaktivierung als kostimulatorisches Molekül eine Rolle. Expression und Aktivität des FasL werden durch transkriptionale (aktivierungsinduzierte Genexpression) und posttranslationale Mechanismen (Speicherung in sekretorischen Lysosomen, aktivierungsinduzierter Transport auf die Zelloberfläche, Proteolyse) kontrolliert. Die als verantwortliche Protease identifizierte Metalloprotease ADAM10 generiert einen löslichen Teil (soluble FasL, sFasL) und ein membranständiges N-terminales Fragment (NTF). Im zweiten Schritt wird das FasL-NTF durch SPPL2a proteolytisch gespalten und die intrazelluläre Domäne (intracellular domain, ICD) ins Zytosol freigesetzt. Es wird vermutet, dass die ICD in den Zellkern transloziert und die Genexpression beeinflusst oder im Zytosol degradiert wird. Abkürzungen: ER, endoplasmatisches Retikulum; PN: perinukleäre Region; mFasL: membrane FasL, membranständiger FasL.
Einleitung
5
Der FasL besitzt nicht nur zytotoxisches Potential, sondern wurde auch als
kostimulatorisches Molekül beschrieben. Die sogenannte reverse Signaltransduktion
ist für verschiedene Mitglieder der TNF-Familie beschrieben worden (z.B. TNF-
(Horiuchi et al., 2010)) und auch für den FasL konnte gezeigt werden, dass
Stimulation mittels FasL-spezifischen Antikörpern oder Fas-exprimierenden Zellen
die T-Zellaktivierung und -proliferation beeinflusst und dass dabei sowohl die CKI-
Bindungsmotive als auch die Prolin-reiche Region eine Rolle spielen (Desbarats et
al., 1998; Suzuki und Fink, 2000; Suzuki et al., 2000; Sun et al., 2006, Paulsen et al.,
2009).
1.1.3 Expression des Fas-Liganden
Die Expression des FasL muss streng reguliert sein, da sein Rezeptor Fas konstitutiv
oder nach Induktion auf vielen unterschiedlichen Zellen exprimiert wird (Nagata und
Golstein, 1995). Der FasL ist vorwiegend auf hämatopoetischen Zellen
nachgewiesen, besonders hoch exprimiert ist er in zytotoxischen T-Lymphozyten und
Natürlichen Killer-(NK-)Zellen. Bereits naive NK-Zellen exprimieren FasL, jedoch wird
durch Stimulation der Zellen eine verstärkte Expression erreicht (Eischen et al., 1996;
Medvedev et al., 1997; Bossi und Griffiths, 1999). CD4-positive TH1-Zellen weisen
nach Stimulation des T-Zellrezeptors einen ansteigenden FasL-Gehalt auf, der bei
CD8-positiven Zellen noch verstärkt auftritt (Janssen et al., 2000b; Suda et al, 1995).
Weiterhin konnte die Expression des FasL auch für Monozyten nachgewiesen
werden (Kiener et al., 1997). Zellen in immunprivilegierten Geweben weisen zur
Wahrung ihrer Integrität den FasL auf ihrer Oberfläche auf (Griffith et al., 2005;
Green und Ferguson, 2001) und auch Tumorzellen exprimieren FasL, um einer
Elimierung durch Lymphozyten zu entkommen (Hahne et al., 1996; O’Connell et al.,
1996; Andreola et al., 2002). Für zytotoxische T- und NK-Zellen, die hohe Level an
endogenem FasL aufweisen, wurde eine Speicherung in speziellen sekretorischen
Lysosomen nachgewiesen (Bossi und Griffiths, 1999; Blott et al., 2001; Schmidt et
al., 2009). Für die Regulation der Oberflächenexpression des FasL wurde der
intrazellulären Domäne mit der Prolin-reichen Region eine wichtige Rolle zugesagt,
an die regulatorisch-wirkende Proteine mit SH3-Domänen binden (Baum et al., 2005;
Lettau et al., 2006; Qian et al., 2006).
Die Fas/FasL-vermittelte Apoptose stellt einen zentralen Mechanismus zur
Aufrechterhaltung der Homöostase innerhalb des Immunsystems dar. Kommt es zu
Einleitung
6
Defekten dieses Systems, z.B. durch Mutationen des Rezeptors oder des Liganden,
sind schwere pathologische Krankheitsbilder die Folge. Das im Kindesalter
auftretende ALPS beruht je nach Subtyp auf einer Mutation des Fas-Rezeptors, des
FasL oder der Caspase-10 (Oliveira et al., 2010). Natürlich auftretende Mausstämme
mit Mutationen des Fas-Gens (lpr, lymphoproliferative disease) oder FasL-Gens (gld,
generalized lymphoproliferative disease) weisen schwere Immundefekte auf. Bei
diesen Stämmen erfolgt nach einer Immunantwort kein AICD und es kommt in der
Folge zur Akkumulation von reaktiven Lymphozyten, Lymphadenopathie und
Splenomegalie (Takahashi et al., 1994; Nagata und Suda, 1995; Nagata, 1994).
1.1.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der Expression des Fas-Liganden
Eine Expression des FasL ist wie erwähnt von großer Bedeutung für ein
funktionierendes Immunsystem und wird deshalb auf verschiedenen Ebenen
kontrolliert (Abbildung 1.2).
1.1.4.1 Transkriptionale Regulation des Fas-Liganden
Die Transkription des FasL wird durch mehrere Transkriptionsfaktoren reguliert, z.B.
NFAT, Irf-1 oder NF-B (Latinis et al., 1997; Chow et al., 2000; Kasibhatla et al.,
1999; Kavurma und Khachigian, 2003). Die Aktivierung des T-Zellrezeptors bewirkt
eine Induktion der Transkription (Dhein et al., 1995). Bei der Aktivierung des
TZR/CD3-Komplexes spielen Src-Kinasen eine wichtige Rolle und ohne ihre
Beteiligung wird die Expression des FasL inhibiert (Dhein et al., 1995; Oberg et al.,
1997).
1.1.4.2 Posttranslationale Modifikationen des Fas-Liganden
Nach Transkription und Translation erfolgt der Transport des FasL auf die
Zelloberfläche oder seine Speicherung in sekretorischen Lysosomen. Beim Transport
des FasL zur Zelloberfläche sowie seiner Lokalisation in bestimmten
Membranregionen spielen Protein-Protein-Interaktionen des FasL mit SH3-Domänen
eine wichtige Rolle. Weiterhin wird die Dichte des membranständigen FasL über eine
proteolytische Prozessierung durch Metalloproteasen reguliert. Die weitere
Proteolyse des N-terminalen Fragmentes durch I-CLiPs führt zur Generierung eines
intrazellulären Fragmentes, welches in den Zellkern translozieren und die
Transkription von Zielgenen induzieren oder einfach degradiert werden könnte.
Einleitung
7
Speicherung in sekretorischen Lysosomen
Zur Kontrolle des zytotoxischen Potentials des FasL erfolgt die Freisetzung auf der
Zelloberfläche unter regulierten Bedingungen. Ein Mechanismus der sicheren
Speicherung des FasL mit der Möglichkeit, schnell, effektiv und vor allem lokal
begrenzt die Oberflächendichte des FasL zur Induktion von Apoptose einer Zielzelle
zu erhöhen, stellt die Assoziation des FasL in sekretorischen Lysosomen dar. Dies
wurde für T- und NK-Zellen nachgewiesen (Bossi und Griffiths, 1999; Blott et al.,
2001; Schmidt et al., 2009). Sekretorische Lysosomen sind bifunktionale Organellen
und weisen die klassischen Eigenschaften von Verdauungsorganellen mit den
charakteristischen Hydrolasen und typischen Membranproteinen wie den Lysosom-
assoziierten Membranproteinen (LAMPs) auf. Sie dienen aber gleichzeitig auch als
Reservoir für auszuschleusende Proteine wie Granzym B und Perforin oder
Membranproteine wie FasL und CTLA-4, die kontrolliert in die immunologische
Synapse entlassen bzw. auf der Zellmembran präsentiert werden und beispielsweise
bei der Lyse infizierter Zellen zusammenwirken (Iida et al., 2000; Blott et al., 2001;
Blott und Griffiths, 2002; Stinchcombe und Griffiths, 2007). Bei Aktivierung, z.B. über
den T-Zellrezeptor, werden die sekretorischen Granula in einem aktinabhängigen
Prozess zur immunologischen Synapse transportiert und fusionieren mit der
Plasmamembran (Lettau et al., 2006). Voraussetzung für die Sortierung des FasL in
sekretorische Lysosomen ist das Vorhandensein der Prolin-reichen Domäne. Fehlt
diese, wird der FasL verstärkt auf der Zelloberfläche präsentiert. In diesem
Zusammenhang wurde eine Interaktion der Prolin-reichen Domäne des FasL mit
regulatorischen Proteinen mit SH3-Domänen vermutet, die den Transport des FasL
in sekretorische Lysosomen steuert (Blott et al., 2001). Es konnte gezeigt werden,
dass der FasL u.a. mit dem Adapterprotein Nck interagiert (Wenzel et al., 2001).
Später stellte sich heraus, dass Nck im Falle einer Aktivierung essentiell für den
Transport des FasL zur immunologischen Synapse ist (Lettau et al., 2006). In
anderen Studien wurde gezeigt, dass Proteine der PCH-(Pombe Cdc15 homology-)
Familie zur Retention des FasL in lysosomalen Kompartimenten und damit zu
verringerter Zytotoxizität beitragen (Baum et al., 2005; Qian et al., 2006). Zuccato
und Kollegen berichteten außerdem, dass der Transport des FasL von
Phosphorylierungen am N-terminalen Ende (Y7/Y9/Y13) durch Src-Kinasen abhängt,
die ihrerseits an die PRD rekrutiert werden (Zuccato et al., 2007).
Einleitung
8
Spezifische Interaktionen mit Proteinen mit SH3-Domänen
Protein-Protein-Interaktionen stellen einen wichtigen Mechanismus zum gerichteten
Ablauf zellulärer Prozesse dar. Spezifische, kontrollierte Interaktionen regulieren die
Verteilung, den Transport und die Signalweiterleitung. Bei vielen Interaktionen
spielen hoch-konservierte Bindungsdomänen eine Rolle, die definierte Motive in
anderen Proteinen erkennen und selektiv an diese binden. Ein wichtiges
Interaktionsmodul stellen SH3-(Src homology 3-)Domänen dar. Sie bestehen aus
etwa 60 Aminosäuren und interagieren mit Proteinen, die bestimmte Prolin-haltige
Sequenzen aufweisen. Oft ist in diesen sogenannten Prolin-reichen Domänen (PRD)
ein PXXP-Motiv enthalten, doch auch davon abweichende Sequenzen sind als
Interaktionsmodule bekannt (Kay et al., 2000; Li, 2005; Mayer, 2006). Die
Interaktionen sind in der Regel konstitutiv und aktivierungsunabhängig. SH3-
Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung von Proteinkomplexen. Im
Gegensatz zu den anderen Mitgliedern der TNF-Superfamilie besitzt der FasL einen
großen intrazellulären Bereich von 80 Aminosäuren (TNF 35 AS; TRAIL 17 AS).
Darin enthalten ist eine Prolin-reiche Domäne (AS 37-80), für die bereits zahlreiche
Protein-Protein-Interaktionen nachgewiesen wurden (Voss et al., 2009).
Beschriebene Interaktionspartner sind verschiedene Tyrosinkinasen der Src-Familie,
Adapterproteine, Mitglieder der PCH-(Pombe Cdc15 homology-)Familie und SNX-
(Sorting Nexin-)Proteine (Hane et al., 1995; Wenzel et al., 2001, Ghadimi et al.,
2002; Baum et al., 2005; Qian et al., 2006; Voss et al., 2009; Lettau et al., 2014;
Voss et al., 2008). Für verschiedene Interaktionen konnte gezeigt werden, dass sie
die Speicherung des FasL in sekretorischen Lysosomen, der Transport aus
sekretorischen Lysosomen zur immunologischen Synapse (siehe oben) und die
Expression des FasL auf der Zelloberfläche in Lipidmikrodomänen (Cahuzac et al.,
2006) regulieren. Ist die PRD deletiert, wird der FasL verstärkt auf der Oberfläche der
Zelle exprimiert (Blott et al., 2001). Dies suggeriert die Bedeutung der Interaktion der
FasL-PRD mit Proteinen mit SH3-Domänen, die den Transport des FasL in
sekretorische Lysosomen begünstigen.
Lokalisation in lipidhaltigen Signalplattformen
Eine weitere Möglichkeit die zytotoxische Effektorfunktion des FasL zu kontrollieren,
besteht in der gezielten Lokalisation in bestimmte Bereiche der Zellmembran. Durch
die Anreicherung von Cholesterol, Sphingolipiden und Phospholipiden kommt es zu
Einleitung
9
Signalplattformen innerhalb der Zellmembran. Die Trennung sogenannter Lipid Rafts
(Simons und Ikonen, 1997) von den lipidärmeren Bereichen der Zellmembran
ermöglicht die Separierung von Proteinen und dessen kontrollierte Rekrutierung
beispielsweise im Rahmen einer Aktivierung (Simons und Toomre, 2000). Auch für
den FasL konnte eine zumindest partielle Assoziation mit Lipidmikrodomänen sowohl
in Transfektanten als auch in primären T-Zellen nachgewiesen werden (Cahuzac et
al., 2006; Nachbur et al., 2006). Dabei wird die Rekrutierung des FasL zu
Lipidmikrodomänen ebenfalls von seiner Prolin-reichen Domäne vermittelt (Cahuzac
et al., 2006; Nachbur et al., 2006). Es wurde außerdem gezeigt, dass die Lokalisation
des FasL in Lipidmikrodomänen durch die Bindung an Fas verstärkt wird und eine
Reduktion des Cholesterolgehalts zu verminderter Zytotoxizität führt (Cahuzac et al.,
2006, Nachbur et al., 2006). Auch für die Regulation der ADAM10-vermittelten
Proteolyse des FasL wurde die Bedeutung von Lipidmikrodomänen analysiert.
Während der unprozessierte FasL sowohl in leichten als auch schweren Fraktionen
von Dichtegradienten detektiert wurde, wurde das N-terminale Fragment (NTF) nur in
leichten Fraktionen nachgewiesen. Reifes ADAM10 wurde in geringen
Konzentrationen in den leichten Fraktionen nachgewiesen, hauptsächlich befand sich
die Protease aber in den schweren Fraktionen, sowohl die Proform als auch die
mature, aktive Form. Behandlung der Zellen mit Cholesteroloxidase und
Metalloproteaseinhibitoren führte zur Reduktion der NTFs (Guardiola-Serrano et al.,
2010). Die proteolytische Prozessierung des FasL in Lipidmikrodomänen wurde auf
die Palmitoylierung eines Cysteins (Aminosäure 82) zurückgeführt, während die
Interaktion von unreifem sowie reifem ADAM10 mit dem FasL unabhängig vom
Palmitoylierungszustand auftrat (Guardiola-Serrano et al., 2010).
Proteolytische Prozessierung durch ADAM-Proteasen
Die Oberflächenexpression des FasL wird weiterhin mittels Proteolyse durch
Metalloproteasen reguliert (Abbildung 1.2). Als hauptverantwortliche Protease wurde
ADAM10 identifiziert (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007). Die Proteolyse von
FasL durch ADAM10 führt zur Reduzierung des membranständigen FasL (membrane
FasL, mFasL) und einer erhöhten Freisetzung des löslichen FasL (soluble FasL,
sFasL). Hierdurch nimmt ADAM10 Einfluss auf die T-Zellfunktionalität und reduziert
die Auslösung des AICD sowie die zytotoxische Wirkung von T-Zellen (Schulte et al.,
2007). sFasL kann durch die Selbstaggregationsdomäne nach wie vor trimerisieren
Einleitung
10
und sowohl pro- als auch anti-apoptotische Eigenschaften konnten gezeigt werden.
Jedoch wurde dem membranständigen FasL ein tausendfach höheres zytotoxisches
Potential als dem löslichen Fragment zugesagt (Schneider et al., 1998; O’Reilly et al.,
2009). Nach erfolgter Proteolyse durch ADAM10 wird im Anschluss das N-terminale
Fragment (NTF) durch SPPL2a aus der SPPL(Signal Peptide Peptidase-like)-Familie
der Aspartyl-Proteasen gespalten (Kirkin et al., 2007). Die ICD des FasL wird in das
Zellinnere entlassen, wo sie möglicherweise Einfluss auf die Transkription nimmt. Sie
könnte aber auch direkt im Zytosol degradiert werden.
1.2 A Disintegrin And Metalloproteases (ADAMs)
Proteolyse stellt eine wichtige posttranslationale Modifikation zur Regulation von
biologischen Prozessen dar. Beim sogenannten Shedding werden
Transmembranproteine irreversibel innerhalb der extrazellulären Domäne gespalten,
wodurch biologische Prozesse entweder initiiert (z.B. bei der Freilassung von
löslichen Faktoren wie TNF-) oder beendet (wie bei der Proteolyse von
Adhäsionsmolekülen, z.B. L-Selektin) werden. Die freigesetzte extrazelluläre
Domäne kann anschließend autokrin oder parakrin wirken. Das Shedding ist
außerdem häufig Voraussetzung für die folgende regulierte intramembrane
Proteolyse (RIPping), bei dem das N- bzw. C-terminale Fragment (NTF, CTF)
proteolytisch weiter prozessiert wird und eine intrazelluläre Domäne ins Zytosol
freigesetzt wird (Weihofen und Martoglio, 2003; Brown et al., 2000). Diese kann wie
im Fall des an Entwicklungsprozessen beteiligten Transmembranproteins Notch bei
der Transkription von Zielgenen aktiv werden (Schroeter et al., 1998; De Strooper et
al., 1999).
Die „A Disintegrin And Metalloproteases“ (ADAMs) stellen die größte Familie der
Sheddasen dar und spielen u.a. eine Rolle bei der Regulation von
Entwicklungsprozessen, Entzündungsreaktionen und der Entstehung bzw.
Ausbreitung von Tumoren. Zusammen mit den Matrix-Metalloproteasen (MMPs),
Snake Venom-Proteasen (SNVPs) und ADAM containing thrombospondin motifs
(ADAMTs) bilden sie die Adamalysin-Subfamilie (Stöcker et al., 1995). ADAM-
Proteine sind phylogenetisch hoch konserviert. Im Menschen umfasst die Familie der
ADAMs 21 verwandte Proteine, von denen jedoch nur 13 an der Proteolyse von
Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Zytokinen und Adhäsionsmolekülen beteiligt sind
(Edwards et al., 2008). Obwohl die Liste von Proteinen, die durch ADAM-Mitglieder
Einleitung
11
gespalten werden, unaufhörlich wächst, sind die näheren Umstände der Regulation
von ADAM-Proteasen nur wenig verstanden. Strukturell weisen die einzelnen
Mitglieder eine gewisse Homologie auf. ADAMs sind Typ-I-Transmembranproteine
mit einer durchschnittlichen Länge von 750 Aminosäuren. Durch den Aufbau in
multiple Domänen sind sie an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt, wie
die Migration von Zellen, Wundheilung und der Verschmelzung von Spermium und
Eizelle. Die generelle Struktur gliedert sich in eine N-terminale Signalsequenz, eine
Prodomäne, die Metalloprotease-Domäne, gefolgt von der Disintegrin-Domäne und
einer membranproximalen Domäne mit einer Cystein-reichen Region und einem
EGF-Motiv. Anschließend folgt eine Transmembrandomäne und C-terminal gelegen
der intrazelluläre Teil, der sich zwischen den einzelnen Mitgliedern der Familie in
Länge und Sequenz unterscheidet, was zu verschiedenen Eigenschaften bezüglich
Reifung, Lokalisation, Aktivität, Regulation und Signalgebung führt (Black und White,
1998; Seals und Courtneidge, 2003). Die ADAM-Familie bevorzugt keine spezifische
Spaltsequenz und es wird vermutet, dass auch die nicht-katalytischen extrazellulären
Domänen zur Substraterkennung beitragen (Reddy et al., 2000; Smith et al., 2002;
White, 2003). Die besondere Stellung der Proteasen ADAM10 und ADAM17 in
Entwicklungsprozessen wurde durch Depletion der verantwortlichen Gene in Mäusen
deutlich, bei denen multiple schwere Defekte auftraten und die Mäuse nicht
lebensfähig waren (Peschon et al., 1998; Hartmann et al., 2002). ADAM10 und
ADAM17 wurden als verantwortliche Proteasen für eine Reihe von Substraten
identifiziert. Teilweise wird ein Substrat von beiden geschnitten, viele Substrate
werden jedoch auch ausschließlich durch eine der beiden Proteasen prozessiert
(Edwards et al., 2008; Saftig und Reiss, 2011). Für den FasL wurde durch
Verwendung von verschiedenen Inhibitoren ADAM10 als Haupt-Sheddase
identifiziert (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007).
1.2.1 Struktur von ADAM10
Die Metalloprotease ADAM10 (CD156c, KUZ, MADM) ist ein proteolytisch aktives
Mitglied der ADAM-Familie. ADAM10 ist ein Typ-I-Transmembranprotein und
entspricht im Aufbau der grundlegenden Struktur der ADAMs (Abbildung 1.3).
Humanes ADAM10 besteht aus 748 Aminosäuren, murines ADAM10 aus 749
Aminosäuren. N-terminal gelegen befindet sich eine Signalsequenz (AS 1-19), die für
den Transport in das endoplasmatische Retikulum benötigt wird. Die Prodomäne
Einleitung
12
(AS 20-213) ist bei der Reifung von ADAM10 von Bedeutung. Sie wirkt inhibierend
auf die proteolytische Aktivität von ADAM10 und hält das Protein in einem latenten
Zustand (Van Wart und Birkedal-Hansen, 1990; Becker et al., 1995; Moss et al.,
2007). Außerdem dient die Prodomäne als Chaperon zur korrekten Faltung der
Protease, insbesondere der Metalloprotease-Domäne (Milla et al., 1999; Anders et
al., 2001). Sie wird durch Proprotein-Konvertasen (PCs) proteolytisch abgespalten
(Pei und Weiss, 1995; Lum et al., 1998; Anders et al., 2001). Die katalytische
Prozessierung der Substrate wird durch die hoch konservierte Metalloprotease-
Domäne (AS 220-456) mit der Kernsequenz HExGHxxGxxHD vermittelt (Schlöndorff
und Blobel, 1999). Die nachfolgende Disintegrin-Domäne (AS 457-551), die bei der
Interaktion mit Integrinen von Bedeutung ist (Reddy et al., 2000; White, 2003), sowie
die membranproximale Domäne (AS 552-672) mit einer Cystein-reichen Region
tragen zur Substraterkennung und zur Zelladhäsion durch Bindung an Glykoproteine
wie Syndecan oder Fibronektin bei (Iba et al., 1999; Janes et al., 2005; Reiss und
Saftig, 2009). Der extrazelluläre Teil von ADAM10 weist verschiedene potentielle N-
Glykosylierungsstellen auf (AS 267, 278, 439, 551; Howard et al., 1996). Im
Anschluss an die Transmembrandomäne (AS 673-693) folgt der intrazelluläre Teil mit
Prolin-reichen Regionen (AS 708-717, AS 722-728) zur möglichen Bindung von SH3-
Domänen. Der intrazelluläre Teil von ADAM10 unterscheidet sich in Mensch und
Maus lediglich im Austausch eines Glutamins zu Prolin (AS 733Q > AS 734 P), was
auf die hoch konservierte regulatorische Funktion der Domäne hindeutet
(Abbildung 1.3). ProADAM10 weist ein berechnetes Molekulargewicht von 84,14 kDa
auf, nach Entfernung der Prodomäne entsteht die reife, aktive Form von ADAM10
(59,4 kDa). Für ADAM10 konnte gezeigt werden, dass die Protease selbst
proteolytisch prozessiert werden kann. ADAM9 und ADAM15 spalten ADAM10
extrazellulär und generieren ein lösliches Fragment (soluble ADAM10, sADAM10)
sowie ein C-terminales Fragment (CTF), welches durch die -Secretase zu einer
intrazellulären Domäne prozessiert und ins Zytosol entlassen wird (Tousseyn et al.,
2009).
Einleitung
13
Abb. 1.3: Schematischer Aufbau von ADAM10. N-terminal befindet sich ein Signalpeptid, anschließend die katalytische Metalloprotease-Domäne. Die Disintegrin-Domäne fungiert bei der Bindung von Integrinen und zusammen mit der Cystein-reichen Region in der membranproximalen Domäne bei der Substraterkennung. Nach der Transmembrandomäne folgt die intrazelluläre Domäne mit zwei Prolin-reichen Regionen zur Interaktion mit SH3-Domänen. Abkürzung: AS, Aminosäure. Modifiziert nach Ebsen et al., 2014.
1.2.2 Funktionen von ADAM10
Durch die Vielzahl an Substraten erfüllt ADAM10 als Sheddase multiple Funktionen
innerhalb eines Organismus, besonders innerhalb des Nervensystems, bei
Entzündungsreaktionen und der Entstehung und Ausbreitung von Tumoren. Die
wichtige Stellung von ADAM10 wurde auch durch genetisch veränderte Mäuse
deutlich, bei denen ADAM10 deletiert war. Durch schwerwiegende Defekte des
zentralen Nerven- und Kardiovaskularsystems waren sie embryonal letal und der
Phänotyp dieses Knockouts ähnelte Mäusen, bei denen Notch mutiert war (Hartmann
et al., 2002). Da ADAM10 selbst prozessiert wird, ist es möglich, dass das ins Zytosol
freigesetzte intrazelluläre Fragment bei der Transkription aktiv wird.
1.2.3 Expression von ADAM10
ADAM-Proteasen wurden in Vertebraten, Insekten und Nematoden nachgewiesen.
Während die Expression bestimmter ADAMs nur auf wenige Gewebe, besonders die
Hoden, beschränkt ist, werden andere (ADAM8, 9, 10, 11, 12, 15, 17, 19, 22, 23, 28
und 33) in einer Vielzahl von Geweben exprimiert. Das Gen für ADAM10 ist im
Einleitung
14
Menschen auf Chromosom 15 (15q21.3-q23; Yamazaki et al., 1997) und in der Maus
auf Chromosom 9 lokalisiert (Yamazaki et al., 1997). ADAM10 wird konstitutiv auf
fast allen Zellen und Geweben exprimiert (Chantry und Glynn, 1990; Wolfsberg et al.,
1996; Yavari et al., 1998; Kärkkäinen et al., 2000). Für einige ADAM-Proteasen (u.a.
ADAM10) wurde nachgewiesen, dass durch alternatives Spleißen verschiedene
Isoformen entstehen, wodurch es neben den membrangebundenen Formen zu
sekretierten Proteasen kommt (Yavari et al., 1998; Hotoda et al., 2002). ADAM10
wird als inaktives Zymogen produziert. Nach Abspalten der Signalsequenz reift
ADAM10 auf dem sekretorischen Weg. Hierbei spielt die Prodomäne eine große
Rolle, da sie inhibierend und als intramolekulares Chaperon bei der korrekten
Faltung wirkt (Van Wart und Birkedal-Hansen, 1990; Becker et al., 1995; Milla et al.,
1999; Anders et al., 2001; Moss et al., 2007). Sie wird proteolytisch durch Furin bzw.
der Proprotein-Konvertase 7 (PC7) entfernt (Anders et al., 2001; Seals und
Courtneidge, 2003). Inhibierend auf die Reifung von ADAM10 zur aktiven Form wirkt
auch die Bindung von Calmodulin, das an eine IQ-Konsensusbindestelle innerhalb
der intrazellulären Domäne von ADAM10 bindet (Horiuchi et al., 2007). Unter
Verwendung pharmakologischer Inhibitoren des frühen sekretorischen Reifungswegs
(Monensin und Brefeldin A) konnte nachgewiesen werden, dass die Reifung und
Aktivierung von ADAM10 im trans-Golgi-Netzwerk stattfindet (Lum et al., 1998;
Roghani et al., 1999; Howard et al., 2000; Anders et al., 2001; Kang et al., 2002). Im
späteren Verlauf der Reifung im trans-Golgi-Netzwerk erfolgt die Glykosylierung von
ADAM10 und nachfolgend der regulierte Transport zum Wirkungsort.
1.2.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der ADAM10-Aktivität
Neben einer generellen Kontrolle der Transkription wurde für verwandte ADAMs
(ADAM9, 12 und 15) gezeigt, dass auf posttranslationaler Ebene eine Regulation
erzielt wird. In diesem Zusammenhang sind u.a. Proteine mit SH3-Domänen, die an
die kurzen intrazellulären Prolin-reichen Regionen der ADAMs binden, von
Bedeutung und auch durch differentielle Lokalisation der ADAMs von ihren
Substraten wird eine Regulation der Aktivität gewährleistet.
1.2.4.1 Transkriptionale Regulation von ADAM10
Die proteolytische Aktivität von ADAM10 wird bereits auf transkriptionaler Ebene
kontrolliert. So wurde gezeigt, dass Retinolsäure, ein Vitamin-A-Metabolit, die
Einleitung
15
Transkription von ADAM10 durch Bindung an spezifische Elemente (retinoic acid
responsive elements, RAREs) innerhalb der Promotorregion verstärkt und zu
steigenden mRNA- und Proteinleveln von ADAM10 führt (Endres et al., 2005;
Holback et al., 2005). Weiterhin wurden einige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die
die Expression von ADAM10 beeinflussen. Der Transkriptionsfaktor PAX2 kann in
renalen Karzimomzellen an die Promotorregion von ADAM10 binden und die
Proteinexpression regulieren (Doberstein et al., 2013). Als ein weiterer induzierender
Transkriptionsfaktor der ADAM10-Genexpression im Zusammenhang der Alzheimer-
Erkrankung wurde das X-Box-Protein 1 (XBP-1) identifiziert (Reinhardt et al., 2014).
In einem Alzheimer-Modell wurde die NAD-abhängige Deacetylase Sirtuin 1 (SIRT1)
als induzierender Faktor der ADAM10-Genexpression im Gehirn nachgewiesen
(Donmez et al., 2010). Weiteren Einfluss nimmt der 5‘-untranslatierte Bereich (5‘-
UTR) der ADAM10-mRNA. Es wurde gezeigt, dass insbesondere der vordere
Bereich des 5‘-UTR durch Ausbildung einer stabilen Sekundärstruktur verantwortlich
für die translationale Suppression von ADAM10 ist (Lammich et al., 2010; Lammich
et al., 2011).
1.2.4.2 Posttranslationale Modifikationen von ADAM10
Über posttranslationale Regulationsmechanismen zur Kontrolle der Aktivität und
Oberflächenexpression von ADAM10 ist bisher wenig bekannt. Nach der Translation
wird die Reifung von ADAM10 im ER und Golgi-Netzwerk streng kontrolliert. Es
konnte für ADAM12 gezeigt werden, dass Proteine mit SH3-Domänen die Aktivität
von ADAM12 beeinflussen und über Endozytoseprozesse die Oberflächendichte
regulieren. Durch die Lokalisation in bestimmten Membranregionen erfolgt eine
Trennung von Substraten und deren Sheddasen. Unter bestimmten Stimuli erfolgt
dann eine Vereinigung mit nachfolgendem Anstieg der Proteolyse. Als ein weiterer
Regulationsmechanismus wird ADAM10 selbst proteolytisch prozessiert, wodurch
eine Regulation der Expression auf der Zelloberfläche und hierdurch der Aktivität
erfolgt.
Subzelluläre Lokalisation
Über die subzelluläre Lokalisation von ADAM10 und auch ADAM17 ist bisher wenig
bekannt. Nach der Translation im ER erfolgt die Reifung unter Abspaltung der
Prodomäne im trans-Golgi-Netzwerk (Lum et al., 1998; Dallas et al., 1999; Lammich
Einleitung
16
et al., 1999; Roghani et al., 1999; Hougaard et al., 2000; Howard et al., 2000;
Schlöndorff et al., 2000; Kang et al., 2002; Gutwein et al., 2003). In der
zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 soll ein Retentionssignal den Transport
und die Reifung von ADAM10 kontrollieren (Marcello et al., 2010). Für die
membranständige Isoform von ADAM12 (ADAM12L) wurde gezeigt, dass Deletion
der intrazellulären Domäne die Speicherung im trans-Golgi-Netzwerk verhindert und
zur Akkumulation von reifem ADAM12 auf der Zelloberfläche führt. Dies wurde auf
ein Retentionssignal innerhalb der zytoplasmatischen und Transmembrandomäne
zurückgeführt (Hougaard et al., 2000). Auch für ADAM10 wurde von zwei
verschiedenen Isoformen durch alternatives Spleißen berichtet, was zu sekretiertem
und membranständigem ADAM10 führte (Yavari et al., 1998). Es gibt viele Berichte
über die Speicherung von ADAM-Proteasen in perinukleären Bereichen und
Kolokalisation mit Golgi-Markern (Lum et al., 1998; Lammich et al., 1999; Hougaard
et al., 2000; Schlöndorff et al., 2000; Kang et al., 2002; Dornier et al., 2012). Da die
proteolytische Prozessierung durch ADAM-Proteasen generell zur Freisetzung der
extrazellulären Domäne von Membranproteinen führt, geht man von der
Zelloberfläche als Ort der Proteolyse aus. Für ADAM-Proteasen und auch speziell für
ADAM10 wurde gezeigt, dass vorwiegend die maturen, aktiven Formen der ADAMs
auf der Zellmembran lokalisiert sind (Black et al., 1997; Lum et al., 1998; Lammich et
al., 1999; Roghani et al., 1999; Schlöndorff et al., 2000; Gutwein et al., 2003; Carey
et al., 2011). Mittels Trypsinierung der Zelloberflächenproteine wurde für ADAM15
gezeigt, dass die Hälfte an reifem ADAM15 intrazellulär gespeichert wird, während
reifes ADAM28 vorwiegend auf der Zelloberfläche nachgewiesen wurde (Lum et al.,
1998; Howard et al., 2000). Mittels Biotinylierung von Membranproteinen wurde
gefunden, dass auf der Zelloberfläche vorwiegend reifes ADAM10 lokalisiert ist,
welches Dynamin-abhängig endozytiert wird (Carey et al., 2011). Es gibt weiterhin
Berichte, dass ADAMs bereits intrazellular aktiv sein können (Lammich et al., 1999;
Skovronsky et al., 2000; Shirakabe et al., 2001; Gutwein et al., 2003). In B-Zellen
wurde für ADAM10 und dessen Substrat CD23 von einer gemeinsamen Freisetzung
über Exosomen berichtet (Padro et al., 2013) und auch in Prostatakarzinomzellen
wurden MICA-, ADAM10- und ADAM17-enthaltende Exosomen extrahiert (Chitadze
et al., 2013). Eine nukleäre Lokalisation von ADAM10 wurde für
Prostatakarzinomzellen (McCulloch et al., 2004) und eine lysosomale Assoziation für
Brustkrebszellen beobachtet (Gutwein et al., 2003). Letztendlich scheinen
Einleitung
17
subzelluläre Lokalisationen der ADAM-Proteasen und der Ort der proteolytischen
Prozessierung je nach Zelltyp, Protease und Substrat zu variieren.
Interaktionen mit regulatorischen Proteinen
Viele ADAM-Proteasen weisen intrazelluläre Bindungsstellen für Proteine mit SH3-
Domänen auf. Die Anzahl dieser Prolin-reichen Domänen (PRDs) variiert stark
zwischen einzelnen Mitgliedern. Während einige ADAMs keine PRDs besitzen (wie
ADAM28), haben andere ein oder zwei PRDs (z.B. ADAM10, ADAM17) oder eine
Vielzahl Prolin-reicher Bindungsstellen (ADAM12, ADAM15). Der Unterschied in der
Anzahl von PRDs weist hierbei auf eine mögliche spezifische Regulation bei
Transport, Lokalisation und/oder Aktivität der jeweiligen ADAMs durch interagierende
Proteine mit SH3-Domänen hin. ADAM10 beinhaltet in der intrazellulären Domäne
zwei Prolin-reiche Regionen zur potentiellen Interaktion mit regulatorischen Proteinen
(Abbildung 1.3). Bisher sind jedoch nur wenige regulatorische Bindungspartner von
ADAM10 bekannt. Für andere ADAMs konnte jedoch der Einfluss von Proteinen mit
SH3-Domänen auf Aktivität und Regulation gezeigt werden. In Xenopus-Embryos
wurde eine Interaktion von X-(Xenopus-)PACSIN2 und ADAM13 nachgewiesen.
Überexpression von X-PACSIN2 konnte Entwicklungsdefekte aufheben, die durch
Überexpression von ADAM13 entstanden (Cousin et al., 2000). In weiteren Analysen
konnte die Interaktion von ADAM12 mit zahlreichen SH3-Domänen verifiziert werden.
Dazu gehörten SH3-Domänen der Src-Kinasen c-Src und Yes (Kang et al., 2000;
Suzuki et al., 2000), das Adapterprotein Grb2 (Suzuki et al., 2000), das
Adapterprotein TKS5 (Five SH3 domain-containing protein = FISH) (Abram et al.,
2003), die p85-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) (Kang et al.,
2001), PACSIN3 (Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons protein 3)
(Mori et al., 2003), die Zytoskelettproteine -Actinin-1 und -2 (Cao et al., 2001;
Galliano et al., 2000) sowie das ADAM-bindende Protein Eve-1 (SH3D19, EBP)
(Tanaka et al., 2004). Für einige der interagierenden Proteine wurde regulatorisches
Potential bezüglich der ADAM-Aktivität nachgewiesen. So verstärkten PACSIN3 und
Eve-1 die ADAM12-vermittelte Proteolyse von HB-EGF (Mori et al., 2003, Tanaka et
al., 2004). ADAM12 wurde durch transiente Interaktion mit c-Src phosphoryliert,
wodurch es zu Änderungen der subzellulären Verteilung von perinukleären Regionen
zur Zellperipherie kam (Stautz et al., 2009). Die Interaktion von Grb2 mit ADAM12
spielt eine Rolle bei der Internalisierung von ADAM12, nimmt jedoch keinen Einfluss
Einleitung
18
auf dessen Aktivität (Stautz et al., 2012). In anderen Analysen wurden die
endozytotisch aktiven Proteine Endophilin-A1 (EEN-B1, SH3GL1) und Sorting Nexin
9 (SNX9, SH3PX1) als interagierende Proteine von ADAM9 und ADAM15 identifiziert
(Howard et al., 1999). Auch für ADAM15 wurde eine Bindung an das Adapterprotein
Grb2 und an verschiedene Mitglieder der Src-Familie (Src, Lck und Hck) gezeigt
(Poghosyan et al., 2002). Als Interaktionspartner von ADAM17 wurde außerdem
SAP97 (Synapse-associated protein 97) identifiziert, welches die proteolytische
Aktivität von ADAM17 beeinflusste (Peiretti et al., 2003). Auch für ADAM10 konnte
eine Interaktion mit SAP97 mit Einfluss auf die Lokalisation von ADAM10 gezeigt
werden (Marcello et al., 2007).
In eigenen Vorarbeiten (Diplomarbeit H. Oberdoerster, 2010) wurde ein erstes
Screening von interagierenden SH3-Domänen der zytoplasmatischen Domäne von
ADAM10 (GST-hADAM10cyt(697-748) durchgeführt. Hierbei wurde eine kommerziell
erhältliche Phagenbibliothek verwendet (All SH3 Domain Phager® von Geneart). Als
Kontrollprotein wurde GST verwendet. Insgesamt wurden 158 Klone sequenziert, die
mit GST und GST-hADAM10(697-748) präzipitierten. Von diesen 158 Klonen
interagierten 45 Klone ausschließlich mit dem intrazellulären Anteil von ADAM10 und
nicht mit der Kontrolle GST. Durch die Sequenzierung wurden 22 SH3-Domänen
identifiziert, von denen die SH3-Domänen von iASPP (inhibitor of ASPP protein;
14 Klone), Endophilin-A2 (5 Klone) und SKAP1 (Src kinase-associated
phosphoprotein 1; 3 Klone) am häufigsten präzipitiert wurden (Abbildung 1.4).
Abb. 1.4: Screening einer Phagenbibliothek zur Identifizierung interagierender SH3-Domänen mit GST-hADAM10(697-748). Von 305 humanen SH3-Domänen wurden 22 ausschließlich als potentielle Interaktoren der zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 identifiziert.
Einleitung
19
Als weiterer Regulationsmechanismus der Expression und Aktivität von ADAM10
wurden Interaktionen mit Tetraspaninen nachgewiesen. Für verschiedene
Tetraspanine (TSPAN12, CD9, CD53, CD63, CD81, CD82, CD151) wurden
Interaktionen mit der reifen Form von ADAM10 gezeigt, die teilweise zu erhöhtem
Shedding führten (Arduise et al., 2008; Xu et al., 2009). Auch für Mitglieder der
TetraspaninC8-Subfamilie (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 und
Tspan33) wurde eine direkte Interaktion mit ADAM10 nachgewiesen (Haining et al.,
2012). Außerdem wurde gezeigt, dass einige der TspanC8-Mitglieder den Transport
von ADAM10 aus dem ER begünstigen und teilweise die Expression von ADAM10
auf der Zelloberfläche regulieren (Dornier et al., 2012).
Lokalisation in verschiedenen Membrankompartimenten
Die Separation von ADAMs und deren Substraten durch Lokalisation in bestimmte
Membrankompartimente sorgt zusätzlich für eine Regulation der Aktivität. So konnte
für zahlreiche ADAM17-Substrate gezeigt werden, dass sie in sogenannten Lipid
Rafts lokalisiert sind (Tellier et al., 2006). In dieser Veröffentlichung wurde auch für
ADAM17 eine Akkumulation in den mit Cholesterol und Sphingolipiden
angereicherten Lipidmikrodomänen nachgewiesen (Tellier et al., 2006). Auflösen der
Signalplattformen durch Cholesteroldepletion führte zu einer erhöhten Freisetzung
von löslichem TNF, TNFR1 und TNFR2 (Tellier et al., 2006). Auch CD30, ein Mitglied
der TNF-Superfamilie, wurde in Rafts detektiert, während ADAM17 in dieser
Publikation von Rafts ausgeschlossen war. Cholesteroldepletion führte auch hier zu
erhöhter Proteolyse von CD30 (von Tresckow et al., 2004). Die proteolytische
Prozessierung des Notch-Liganden Jagged1 durch ADAM17 wurde im Gegensatz als
Raft-unabhängig beschrieben (Parr-Sturgess et al., 2010). Für weitere ADAM-
Proteasen ist ebenfalls eine differentielle Lokalisation von ihren Substraten zur
Regulation der Aktivität bekannt. Für das amyloide Vorläuferprotein (amyloid
precurser protein, APP) wurde gezeigt, dass die Verminderung des
Cholesterolgehalts in verstärktem Shedding von APP durch ADAM10 und folglich
einem Anstieg des neuroprotektiven löslichen Fragmentes resultierte (Kojro et al.,
2001). In einer weiteren Publikation wurden verschiedene Lokalisationen von APP,
sowohl Raft-assoziiert als auch nicht Raft-assoziiert, nachgewiesen. Dies führte zu
Unterschieden in der proteolytischen Prozessierung durch -Sekretasen (Rafts) oder
Einleitung
20
-Sekretasen (außerhalb der Rafts) (Ehehalt et al., 2003). Auch das Glykoprotein
CD44 wurde in Lipid Rafts detektiert, während ADAM10 außerhalb der Rafts
nachgewiesen wurde. Durch Reduktion von zellulärem Cholesterol kam es zu einer
verstärkten Proteolyse von CD44 (Murai et al., 2011). Auch für andere Substrate von
ADAMs wurde ein Effekt von verändertem Cholesterolgehalt auf die Proteolyserate
gezeigt, z.B. für den Interleukin-6-Rezeptor (IL6R) (Matthews et al., 2003), L1-CAM
(Mechtersheimer et al., 2001), und die Kollagene XVII und XXIII (Zimina et al., 2005;
Veit et al., 2007). In Zusammenhang mit dem FasL und ADAM10 wurde in
vorhergehenden Untersuchungen eine Lokalisation von geringen Mengen an reifem
ADAM10 in Lipid Rafts nachgewiesen. Unreifes ADAM10 wurde lediglich außerhalb
Raft-assoziierter Fraktionen detektiert (Guardiola-Serrano et al., 2010).
1.2.5 Implikationen von ADAM-Proteasen bei bestimmten Krankheitsbildern
ADAM-Proteasen spielen eine wichtige Rolle innerhalb des Immunsystems und sind
in einer Vielzahl von Krankheitsbildern impliziert. Neben Asthma und rheumatoider
Arthritis wurde auch bei der Entstehung multipler dermatologischer Pathologien
gezeigt, dass Proteolyse eine Rolle spielt (Kawaguchi und Hearing, 2011; Duffy et
al., 2011). So wurde z.B. für E-Cadherin bzw. N-Cadherin gezeigt, dass eine
reduzierte Expression durch Proteolyse zur verminderten Adhäsion von
Keratinozyten und Ausbildung von Ekzemen, Morbus Hailey-Hailey, Morbus Darier,
Psoriasis und Pemphigus vulgaris (Blasensucht) führt (Burge und Schomberg, 1992;
Furukawa et al., 1994; Chung et al., 2005; Reiss et al., 2005; Maretzky et al., 2008).
Eine Beteiligung von ADAMs wurde auch in anderen Krankheiten nachgewiesen. In
Bezug auf die Proteolyse von APP wurde für ADAM10 eine neuroprotektive Wirkung
bei der Alzheimer-Erkrankung gezeigt. APP kann durch mehrere Proteasen
gespalten werden, wodurch unterschiedliche Fragmente generiert werden. Bei dem
amyloidogenen Weg führt die Prozessierung von APP durch die β-Sekretase BACE-
1 zur Formierung des löslichen Fragmentes sAPPβ und dem membranständigen C-
terminalen Fragment (CTF C99), welches anschließend durch γ-Sekretasen weiter
prozessiert wird. Das entstehende Aβ-Peptid trägt hauptsächlich zum Krankheitsbild
der Alzheimer-Erkrankung bei. Bei dem nicht-amyloidogenen Weg verhindert
ADAM10 als α-Sekretase das Shedding von APP zu den toxischen Fragmenten und
führt stattdessen zur Generierung des löslichen neuroprotektiven Fragmentes sAPPα
Einleitung
21
und einem kürzeren membranständigen CTF (CTF C83) (Endres und Fahrenholz,
2012).
Bei verschiedenen Tumoren wurde gezeigt, dass ADAM-Proteasen konstitutiv aktiv
oder überexprimiert sind und zur Metastasierung beitragen (z.B. durch Proteolyse
von Adhäsionsmolekülen oder Wachstumsfaktoren) (McCulloch et al., 2004; Knösel
et al., 2005; Lendeckel et al., 2005; Gavert et al., 2007; Ko et al., 2007; Mochizuki
und Okada, 2007; Kohutek et al., 2009; Duffy et al., 2009; Gaida et al., 2010;
Armanious et al., 2011). Durch den großen Einfluss von ADAMs bei Zelladhäsion,
-migration, Entzündungsprozessen und Krebs sind sie im Focus möglicher
Therapieansätze. In einigen Versuchen wurde die Aktivität von ADAMs durch
synthetische Inhibitoren (Duffy et al., 2011; Rose-John, 2013), aufgereinigte oder
synthetisch hergestellte Prodomänen (Moss et al., 2007; Gonzales et al., 2004),
veränderte Varianten der natürlich auftretenden Inhibitoren von ADAMs (TIMPs,
tissue inhibitors of metalloproteases) (Huovila et al., 2005; Rapti et al., 2008;
Kveiborg et al., 2010) oder monoklonale Antikörper (Lendeckel et al., 2005) inhibiert.
Synthetische Inhibitoren wurden in klinischen Studien getestet und führten u.a. zu
reduziertem Wachstum von Tumoren (Duffy et al., 2011). Bei der Behandlung von
rheumatoider Arthritis mit ADAM17-Inhibitoren traten aber auch akute
Nebenwirkungen wie Hepatotoxizität auf, weshalb die Studien nicht weiter geführt
werden konnten (Moss et al., 2008; Duffy et al., 2011). Um den Einfluss der ADAM-
Proteasen bei bestimmten Krankheitsbildern für mögliche Therapien nutzen zu
können, ist es wichtig, die genauen molekularen Regulationsmechanismen und
Zusammenhänge zu verstehen. Durch die Vielzahl an Substraten ist eine Erhöhung
bzw. eine Reduktion der ADAM-Aktivität immer mit weiteren Immunreaktionen
innerhalb des Organismus verbunden und muss bei einer eventuellen Therapie
berücksichtigt werden.
Fragestellung
22
2. Fragestellung
Durch vorhergehende Untersuchungen innerhalb der Arbeitsgruppe konnte eine
Regulation des FasL durch proteolytische Prozessierung von Mitgliedern der A
Disintegrin and Metalloprotease- (ADAM)-Familie gezeigt werden. Hierbei wurde
durch den Einsatz synthetischer Inhibitoren ADAM10 als hauptverantwortliche
Protease identifiziert. Die Regulationsmechanismen von ADAM10, im Speziellen im
Kontext mit der Proteolyse des FasL, sind jedoch weitestgehend unbekannt und
auch die subzelluläre Lokalisation von ADAM10 in T-Zellen wurde bisher nicht
analysiert. Basierend auf den vorhergehenden Ergebnissen ergaben sich für die
vorliegende Arbeit folgende Ziele:
1) Eine Induktion der Proteolyse verschiedener Substrate von ADAM10 und
ADAM17 wird vorwiegend über den Einsatz von TPA (Aktivierung der
Proteinkinase C), sowie durch Verwendung des Kalziumionophors Ionomycin
(Kalziumeinstrom) erzielt. Auch bezüglich der induzierten Prozessierung des FasL
wird diese Kombination meist verwendet. Im Rahmen der Arbeit sollte detailliert
analysiert werden, welchen Einfluss die beiden unphysiologischen Stimuli einzeln
und in Kombination auf die Proteolyse des FasL nehmen.
2) Zur Feststellung der hauptverantwortlichen Protease bei der Proteolyse des
FasL sollten die Inhibitoren-basierenden Ergebnisse durch spezifische
Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 mittels transienter Transfektion mit
siRNAs und anschließender Induktion der Proteolyse verifiziert werden.
3) Die Expression des FasL ist auf wenige Zelltypen beschränkt und spielt vor
allem bei der Funktionalität von T-Zellen eine Rolle. Aus diesem Grund sollte
nachfolgend untersucht werden, welche Auswirkungen eine T-Zellrezeptor-
spezifische Stimulation über Verwendung von anti-CD3/CD28-Antikörpern auf die
proteolytische Prozessierung des FasL hat.
4) Während die subzelluläre Lokalisation des FasL bereits näher untersucht
wurde, gibt es über ADAM10 und ADAM17 in diesem Kontext nur wenig bekannte
Details. Zur näheren Untersuchung einer möglichen intrazellulären Kolokalisation von
Fragestellung
23
Substrat und Protease sollte die eventuelle Speicherung der Proteasen in
intrazellulären Vesikeln, den sogenannten sekretorischen Lysosomen, in denen auch
der FasL gespeichert wird, analysiert werden. Weiterhin sollte die
Oberflächenexpression und eine mögliche Kolokalisation des FasL und ADAM10 in
Lipidmikrodomänen auf der Zellmembran näher untersucht werden.
5) ADAM10 besitzt zwei intrazelluläre Prolin-reiche Regionen mit putativen SH3-
Bindungsmotiven. Mehrere potentiell interagierende Proteine mit SH3-Domänen
konnten bereits in Vorarbeiten identifiziert werden. Die Analyse von Protein-Protein-
Interaktionen von ADAM10 mit Proteinen mit SH3-Domänen sollte ausgeweitet
werden. Identifizierte Bindungspartner sollten verifiziert und eventuell ihr Einfluss auf
ADAM10 und die Proteolyse des FasL untersucht werden.
Material und Methoden
24
3. Material
3.1 Material für die Zellbiologie
3.1.1 Zellkultur
Für die Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood
mononuclear cell, PBMC) wurden Leukozytenkonzentrate (Buffy-Coat-Präparate)
gesunder Spender verarbeitet, die vom Institut für Transfusionsmedizin, UK S-H
Campus Kiel bzw. Campus Lübeck, zur Verfügung gestellt wurden. Ein
entsprechendes Ethikvotum der Kommission der Medizinischen Fakultät der
Christian-Albrecht-Universität zu Kiel (D405/10) zur Verwendung der Blutproben
sowie die schriftlichen Einverständniserklärungen der Blutspender liegen vor. CD4-
positive T-Zellklone 12603/12632 wurden in der Arbeitsgruppe generiert und
beschrieben (Lettau et al., 2006), ebenso wie die mit hFasL stabil-transfizierte Jurkat-
Zelllinie JFL39.1 (Qian et al., 2006). Weiterhin wurde die Jurkat-Zelllinie JE6-1
(ATCC TIB 152), sowie die humane embryonale Nierenzelllinie 293T (ATCC CRL-
1573) für Experimente kultiviert. Für Restimulationen der T-Zellklone wurde die EBV-
transformierte B-Zelllinie EBV-W verwendet, die innerhalb des Instituts für
Immunologie generiert wurde.
3.1.2 Bakterien und Phagen
E. coli-Bakterien (Stamm DH5 bzw. BL-21, Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad,
USA) wurden nach Standardprotokollen passagiert und zur Transfektion vorbereitet.
Der E. coli-Stamm TG1 wurde von Stratagene (La Jolla, CA, USA) bezogen. Für die
Identifizierung von interagierenden SH3-Domänen wurde eine kommerziell
erhältliche Phagenbibliothek verwendet (All SH3 Domain Phager®, Geneart AG,
Regensburg).
Material und Methoden
25
3.1.3 Medien und Puffer
3.1.3.1 Zellkulturmedien/Zusätze für die Zellkultur
Gibco® RPMI 1640 mit 25 mM HEPES und L-Glutamin Life Technologies, Karlsruhe
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium) Biochrom AG, Berlin
Penicillin/Streptomycin (10000 U/10000 μg) Biochrom AG
FCS (fötales Kälberserum/fetal calf serum; 30 min inaktiviert bei 56 °C, sterilfiltriert (0,22 µm))
Life Technologies
L-Glutamin (200 mM) Biochrom AG
Zellkulturmedien wurden vor der Verwendung mit 1% (v/v) Antibiotika und 5-10% (v/v)
FCS versetzt. DMEM-Medium wurde zusätzlich mit 1% (v/v) L-Glutamin versetzt.
Einfriermedium wurde aus Zellkulturmedium mit 20% (v/v) FCS und 10% (v/v) DMSO
hergestellt und vor dem Einfrieren heruntergekühlt.
PBS (Phosphate-buffered saline)
Biochrom AG
Trypsin/EDTA (0,5%/0,2% (w/v)) Biochrom AG
Trypanblau-Lösung (0,1% Trypanblau in PBS) Sigma-Aldrich, München
Ficoll (1,077 g/ml) Biochrom AG
Proleukin® S (rekombinantes Interleukin-2, 10 U/ml ) Chiron, Marburg
Phytohämagglutinin (PHA, 0,5 µg/ml) Murex Biotech, Dartford, UK
3.1.3.2 Kalzium-Phosphat-Transfektion
HBS-Puffer (2x)
- 50 mM HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-
ethansulfonsäure)
- 280 mM NaCl
- 1,5 mM Na2HPO4 x 2H2O
pH 7,17; sterilfiltriert (0,22 µm)
Merck
Carl Roth, Karlsruhe
Merck
Kalziumchlorid-Lösung
- 2,5 mM CaCl2
sterilfiltriert (0,22 µm)
Merck
Material und Methoden
26
3.1.3.3 Konfokale Mikroskopie
Poly-L-Lysin-Lösung
- 100 µg/ml Poly-L-Lysin in PBS
Sigma-Aldrich
PEM-Puffer (2x)
- 200 mM PIPES (Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)
- 2 mM MgCl2
- 2 mM EGTA (bis-(Aminoethyl)glycolether- N,N,N´,N´-tetraessigsäure)); pH 6,95; sterilfiltriert (0,22 µm)
Carl Roth
Merck
Merck
Borat-Puffer (2x)
- 200 mM Natriumborat (Na2B4O7)
- 2 mM MgCl2
pH 11,0; sterilfiltriert (0,22 µm)
Merck
Merck
Fixierungspuffer
- 6% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) in PBS, pH 7,0
Merck
Permeabilisierungspuffer
- 1% (v/v) Triton X-100 in PBS
Merck
Reduktionslösung
- 1 mg/ml NaBH4 in Wasser
Carl Roth
Blockierungspuffer
- 0,2 % (w/v) BSA
- 0,01 % (v/v) Triton X-100 in PBS
Serva, Heidelberg
Merck
Eindeckelmedium (Gold Prolong Antifade Reagent Mounting Medium mit DAPI)
Life Technologies
Der Fixierungspuffer wird vor der Fixierung der Proben mit gleichen Volumen PEM-
Puffer (2x) bzw. Borat-Puffer (2x) gemischt.
3.1.3.4 Durchflusszytometrie
FACS-Waschpuffer
- 1% (w/v) BSA in PBS, sterilfiltriert (0,22 µm)
Serva, Biochrom AG
Fixierungspuffer
- 1% (w/v) PFA in PBS
sterilfiltriert (0,22 µm)
Merck
Propidiumiodidlösung
- 4 µg/ml in PBS
Serva
Material und Methoden
27
3.1.3.5 Antikörper
Tabelle 3.1: Primärantikörper für Analysen humaner Zellen
Primärantikörper Klon Konzentration Applikation Hersteller
DZ KM
α-CD3 OKT3 1 mg/ml / / Cilag, Sulzbach
α-CD28 CD28.2 1 mg/ml / / BD Pharmingen, Heidelberg
α-ADAM10 AD214Y 0,2 mg/ml 1/20 / Santa Cruz, CA, USA
α -ADAM10-PE SHM14 50 µg/ml 1/10 1/10 Biolegend, London, UK
α-ADAM17 A300E 0,5 mg/ml 1/30 / AG Grötzinger, Biochemie, CAU
α-ADAM17-PE 111633 25 µg/ml pur / R&D Systems, Wiesbaden
α-FasL-PE Alf-2.1A 1 mg/ml 1:50 / Ancell, Bayport, MN, USA
Abkürzungen: DZ, Durchflusszytometrische Analyse; KM, Konfokale Mikroskopie; k.A., keine Angabe des Herstellers
Tabelle 3.2: verwendete Isotypkontrollen und Sekundärantikörper
Antikörper Klon Konzentration Applikation Hersteller
DZ KM
Isotypkontrollen
Maus-IgG1-PE X-40 50 µg/ml 1/2,5 1/10 1/10 BD Pharmingen
Maus-IgG1-PE k.A. k.A. 1/5 / Immunotools, Friesoythe
Maus-IgG1 MOPC-21 0,5 mg/ml 1/30 / Abcam, Cambridge, UK
Maus-IgG2a MOPC-173 0,5 mg/ml 1/100 / Abcam
Maus-IgG2b k.A. k.A. 1/100 / Immunotools
Sekundärantikörper
Ziege--Maus-PE k.A. k.A. 1/60 / Immunotools
Kaninchen--Maus (RaM)
k.A. 1,8 mg/ml / / Dianova, Hamburg
Abkürzungen: DZ, Durchflusszytometrische Analyse; KM, Konfokale Mikroskopie; k.A., keine Angabe des Herstellers
Material und Methoden
28
3.1.4 Weitere Reagenzien und Inhibitoren (Angabe der Einsatzkonzentration)
Tetradecanoylphorbolacetat (TPA, 10 ng/ml) Sigma-Aldrich
Ionomycin (500 ng/ml) Life Technologies
Methyl-β -Cyclodextrin (MβCD, 5-10 mM) Sigma-Aldrich
PP1 (Src-Kinase-Inhibitor, 10 µM) Sigma-Aldrich
2-Brompalmitat (2BP, 100 µM) Sigma-Aldrich
2-Hydroxymyristylsäure (2HMA, 100 µM) Santa Cruz
3.1.5 Verwendete Kits für die Zellbiologie
Human T Cell Nucleofector Kit Lonza Group AG, Basel
3.2 Material für molekularbiologische Experimente
3.2.1 Vektoren und Konstrukte
Tabelle 3.3: verwendete Vektoren und Konstrukte
Insert Vektor Bezugsquelle
- pGEX-2T GE Healthcare, UK
- pGEX-4T3 GE Healthcare, UK
- pcDNA3.1/myc-HisA Life Technologies
- pEGFP-C1 Life Technologies
hPACSIN1 pcDNA3.1/myc-HisA e.H.
hPACSIN2 pcDNA3.1/myc-HisA e.H.
hPACSIN3 pcDNA3.1/myc-HisA e.H.
hSNX9 peak12linker S.F. Lichtenthaler, München
hSNX18 peak12linker S.F. Lichtenthaler
hSNX33 peak12linker S.F. Lichtenthaler
hEndophilin-A2/EEN pCMV4/TO Origene Technologies, Rockville, MD, USA
Abkürzung: e.H., eigene Herstellung (Labor AG Janssen)
Material und Methoden
29
3.2.2 Primer
Tabelle 3.4: verwendete Primer
Name Sequenz
GAPDH 5‘ GACCCCTTCATTGACCTC
GAPDH 3‘ CCAAAGTTGTCATGGATG
pGEX-2T 5‘ CTGGCAAGCCACGTTTGG
pGEX-2T 3‘ GGGAGCTGCATGTGTCAG
EEN-SH3 5‘ TGGGATCCCTGGACCAGCCGAGCTGC
EEN-SH3 3‘ TGGGATTCGGGCACAAGCACCTCCAC
J-55 CCTATTGCCTACGGCAGCC
H-301 CGTTTTCGCCGGAAACTGAGGGAC
Alle verwendeten Primer wurden über MWG Eurofins Genomics, Ebersberg, bezogen.
3.2.3 siRNAs
Tabelle 3.5: verwendete siRNAs für transiente Transfektionen
siRNA ID Bezugsquelle
ADAM10_1 HSS100167 Invitrogen/Life Technologies
ADAM10_2 HSS173546 Invitrogen/Life Technologies
ADAM10_3 HSS100165 Invitrogen/Life Technologies
ADAM17_1 HSS186181 Invitrogen/Life Technologies
ADAM17_2 HSS110434 Invitrogen/Life Technologies
ADAM17_3 HSS110435 Invitrogen/Life Technologies
SPPL2a_1 HSS131389 Invitrogen/Life Technologies
SPPL2a_2 HSS131390 Invitrogen/Life Technologies
SPPL2a_3 HSS131391 Invitrogen/Life Technologies
Scramble-Negativkontrolle_low 12935-200 Ambion/Life Technologies
Scramble-Negativkontrolle_med 12935-300 Ambion/Life Technologies
GAPDH-Positivkontrolle 12935-140 Ambion/Life Technologies
3.2.4 Enzyme für die Molekularbiologie
EcoRI
BamHI
NEB, Ipswich, USA
NEB
DreamTaq-DNA-Polymerase Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
Pfu-DNA-Polymerase Thermo Fisher Scientific
T4-DNA-Ligase NEB
Material und Methoden
30
3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese
Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE, 50x)
- 242 g/l Tris (Tris-hydroxymethyl-Aminomethan)
- 55 g Borsäure
- 40 ml 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
auf 1 L mit ddH20
Merck
Carl Roth
Merck
Braun, Melsungen
Agarosegele
- UltraPure® Agarose
- 1x TAE-Puffer
- 0,5 mg/ml Ethidiumbromid
Life Technologies
s.o.
Merck
Probenpuffer für Agarosegele (10x) Life Technologies
Molekulargewichtsstandards
- 100 bp DNA Ladder
- 1 kb DNA Ladder
Life Technologies
Life Technologies
3.2.6 Puffer und weitere Reagenzien
LB-Medium
- 10 g/l Pepton
- 5 g/l Hefeextrakt
- 10 g/l NaCl
autoklavieren
- 50 µg/ml Ampicillin/Kanamycin
Carl Roth
Carl Roth
Carl Roth
Merck/Serva
LB-Agarplatten
- 15 g/l Agar-Agar in 1 l LB-Medium
autoklaviert, je 15-25 ml in sterile Platten gegossen
Serva
Circle-Grow-Medium
- 40 g/l Circle-Grow-Pulver, autoklaviert
Bio101 Inc., Carlsbad,
CA, USA
dNTPs Thermo Fisher Scientific
3.2.7 Material für das Screening interagierender SH3-Domänen
All SH3 Domain Phager® Geneart AG, Regensburg
Dynabeads® M-270 Epoxy Invitrogen
Material und Methoden
31
Natriumphosphatpuffer
- 2,62 g/l NaH2PO4 x H2O
- 14,42 g/l Na2HPO4 x 2H2O
auf pH 7,4 einstellen
Merck
Merck
Ammoniumsulfatlösung
- 39,6 g Ammoniumsulfat in 100 ml Natriumphosphatpuffer
Merck
Waschpuffer
- 0,5% Tween-20 in PBS
Merck
Blockierungspuffer
- 5% BSA (w/v) in Waschpuffer
Serva
Elutionspuffer
- 200 mM Glycin
auf pH 2,2 einstellen
Carl Roth
1 M Tris-Puffer, pH 9,0 Merck
SOBAG-Platten
- 20 g/l Pepton
- 5 g/l Hefeextrakt
- 0,5 g/l NaCl
- 15 g/l Agar-Agar
autoklavieren
- 2,5 mM MgCl2 (Stock: 1 M)
- 100 mM D-Glucose (Stock: 1 M)
- 100 µg/ml Ampicillin
je 25 ml in Platten gegossen
Carl Roth
Carl Roth
Merck
Serva
Merck
Merck
Merck
3.2.8 Kits für die Molekularbiologie
BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Life Technologies
DyeEx® 2.0 Spin Kit Qiagen, Hilden
RNeasy® Mini Kit Qiagen
QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen
QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen
QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen
QIAGEN® Plasmid Maxi Kit Qiagen
First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific
Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) Thermo Fisher Scientific
Material und Methoden
32
3.3 Material für biochemische Analysen
3.3.1 Puffer und Reagenzien
3.3.1.1 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen
Glutathion SepharoseTM 4B-Beads GE Healthcare, Freiburg
Isopropyl-1-thio-Galactopyranosid (IPTG, 0,1 M) Merck
Lysepuffer
- 1% (v/v) Triton X-100 in PBS
Merck
Elutionspuffer
- 10 mM Glutathion reduziert
- 50 mM Tris-Puffer pH 8,0
Sigma-Aldrich
Merck
3.3.1.2 Lysieren von Zellen
Lysepuffer
- 1% (v/v) Nonidet® P40 (NP-40)
- 20 mM Tris-Puffer, pH 7,4
- 0,15 M NaCl
(- 5 mM EDTA)
Sigma-Aldrich
Merck
Carl Roth
Merck
Inhibitoren
- 2 µg/ml Aprotinin
- 2 µg/ml Leupeptin
- 1 mM AEBSF
- 2 µg/ml Pepstatin A
- 1 mM Natriumorthovanadat
- 10 mM Natriumfluorid
- 1 mM Natriumpyrophosphat
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Biochrom AG
Merck
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
3.3.1.3 Proteinbestimmung
Coomassie-Protein-Assay-Reagenz Thermo Fisher Scientific
3.3.1.4 Pull-Down/Immunpräzipitation
Protein-G-SepharoseTM 4B-Beads GE Healthcare
Glutathion-SepharoseTM 4B-Beads GE Healthcare
Material und Methoden
33
3.3.1.5 SDS-PAGE: Protean II-System (Bio-Rad)
Laufgel (30 ml pro Gel, 10%)
- 10 ml 30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid
- 11,2 ml 1 M Tris-Puffer, pH 8,8
- 300 µl SDS (10% in ddH20)
- 8,7 ml ddH20
- 100 µl 20% Ammoniumperoxodisulfat (APS)
- 20 µl N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin (TEMED)
Carl Roth
Merck
Merck
Braun
Merck
GE Healthcare
Sammelgel (10 ml pro Gel)
- 1,67 ml 30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid
- 1,25 ml 1 M Tris-Puffer, pH 6,8
- 100 µl SDS (10% in ddH20)
- 7,03 ml ddH20
- 50 µl 20% APS
- 10 µl TEMED
Carl Roth
Merck
Merck
Braun
Merck
GE Healthcare
Elektrophoresepuffer (10 x)
- 250 mM Tris
- 1,92 M Glycin
- 0,1% SDS
Vor Gebrauch wurden 500 ml mit 4,5 l ddH20 gemischt.
Merck
Merck
Serva
Probenpuffer
- 6% (w/v) SDS
- 30% (v/v) Glycerin
- 200 mM Tris, pH 6,8
- 0,005% Bromphenolblau
- 2-5% -Mercaptoethanol
Serva
Carl Roth
Merck
Merck
Merck
Protein-Molekulargewichtsstandards
- Low Range-Standard
- Precision Plus Protein All Blue-Standard
Bio-Rad, München
Bio-Rad
3.3.1.6 SDS-PAGE: NuPAGE®-System (Invitrogen)
NuPAGE® MES 20x SDS-Laufpuffer (1:20 mit ddH20) Life Technologies
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Proteingele Life Technologies
Material und Methoden
34
3.3.1.7 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen
Coomassie-Färbelösung
- 410 ml Methanol
- 70 ml Essigsäure (100%ig)
- 0,125 g Coomassie Brilliant Blue G250
- 510 ml ddH20
Carl Roth
Carl Roth
Bio-Rad
Braun
Coomassie-Entfärbelösung
- 410 ml Methanol
- 70 ml Essigsäure (100%ig)
- 510 ml ddH20
Carl Roth
Carl Roth
Braun
3.3.1.8 Western Blot
Transferpuffer
- 25 mM Tris
- 192 mM Glycin
- 20% Methanol
- 0,015% (v/v) SDS
Merck
Merck
Carl Roth
Merck
Protein-Färbelösung
- Ponceau-S
- 5% Essigsäure (100%ig)
Carl Roth
Carl Roth
Waschpuffer (TBS)
- 10 mM Tris
- 0,15 M NaCl
pH 7,5-8,0
Merck
Carl Roth
Waschpuffer (TBS-T)
- 10 mM Tris
- 0,15 M NaCl
- 0,05% Tween-20
Merck
Carl Roth
Merck
Blockierungslösung
- 100 mM Tris pH 7,5
- 2,2% (w/v) NaCl
- 5% (w/v) BSA
- 0,01% (w/v) Natriumazid
Merck
Carl Roth
Serva
Braun
Material und Methoden
35
Strippinglösung
- 62,5 mM Tris pH 6,8
- 2% (v/v) -Mercaptoethanol
- 6,9% (w/v) SDS
Merck
Merck
Serva
ECL-Detektionsreagenz GE Healthcare
3.3.2 GST-Fusionsproteine
Tabelle 3.6: verwendete GST-Fusionsproteine
Fusionsprotein Konzentration Applikation Bezugsquelle
GST-ADAM10cyt(697-748) 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-ADAM17cyt(694-824) 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Abl-SH2 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Abl-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Fyn-SH2 0,45 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Fyn-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Fyn-SH2-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Hck-SH 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Hck-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Src-SH2 0,44 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Src-SH3 1,7 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Yes-SH3 0,8 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Lck-SH2 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Lck-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Lck-SH2-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grb2-SH2 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grb2-SH3C 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grb2-SH3N 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grap-SH3C 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grap-SH3N 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grap2-SH3C 0,9 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-Grap2-SH3N 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-PACSIN1-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-PACSIN2-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-PACSIN3-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
GST-EEN-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.
Abkürzung: e.H., eigene Herstellung (Labor AG Janssen)
Material und Methoden
36
3.3.3 Antikörper
Tabelle 3.7: Antikörper für biochemische Analysen
Antikörper Klon/Nr. Konzentration Applikation Bezugsquelle
WB IP
Primärantikörper
Α-ADAM10 11G2 1 mg/ml 1:2000 1-2 µg/ml Hölzel Diagnostika, Köln
α-ADAM10 Tier 1 1 mg/ml 1:500 / Prof. Saftig, CAU Kiel
α-ADAM17 A318 0,5 mg/ml 1:500 / Prof. Grötzinger, CAU Kiel
α-ADAM17 H300 0,2 mg/ml 1:500 / Santa Cruz
α-BiP/Grp78 40 0,25 mg/ml 1:250 / BD Biosciences
α-COXIV 10G8D12C12
1 mg/ml 1:1000 / Abcam/ MitoSciences
α-Endophilin-A2 2F5 1 mg/ml 1:2000 1 µg/ml Abcam
α-FasL N20 0,2 mg/ml 1:500 / Santa Cruz
α-FasL FcII 1 mg/ml 1:1000 2 µg e.H.
α-GAPDH 6C5 2 mg/ml 1:2000 / Abcam
α-Granulysin AF3138 0,2 mg/ml 1:1000 / R&D Systems
α-Granzym B 2C5/F5 0,5 mg/ml 1:2500 / BD Biosciences
α-Grb2 C-23 0,2 mg/ml 1:500 / Santa Cruz
α-HA 3F10 0,1 mg/ml 1:500 1-2 µg/ml Roche, Grenzach-Whylen
α-Katalase ab1877 10 mg/ml 1:1000 / Abcam
α-LAMP-1 25 0,25 mg/ml 1:500 / BD Biosciences
α-LAT 9166 k.A. 1:1000 / Cell Signaling, Danvers, USA
α-Lck 4/129 1 mg/ml 1:1000 1-2 µg/ml e.H.
α-Lck 4/215 1 mg/ml 1:1000 1-2 µg/ml e.H.
α-myc 46-0603 1,2 mg/ml 1:5000 / Life Technologies
α-pTyr 4G10 1 mg/ml 1:5000 e.H.
Sekundärantikörper
α-Maus-IgG-HRP NA9310 k.A. 1:7500 / GE Healthcare
α-Kaninchen-IgG-HRP
NA9340 k.A. 1:5000 / GE Healthcare
α-Ratte-IgG-HRP NA935 k.A. 1:5000 / GE Healthcare
Abkürzungen: WB, Western Blot; IP, Immunpräzipitation; HRP, Meerrettich-Peroxidase; CAU, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel; e.H., eigene Herstellung (Labor AG Janssen)
Material und Methoden
37
3.3.4 Kits für die Biochemie
Lysosome Isolation Kit Sigma-Aldrich
Human Fas Ligand DuoSet R&D Systems
3.4 Weitere Materialien
Amicon® Ultra Konzentrator 10000 MWCO
Amicon® Ultra Konzentrator 30000 MWCO
Bakterienimpfösen/-nadeln
Branson Sonifier 450
Deckgläser (18 mm)
Einfrierröhrchen CryoTubeTM
FACS-Röhrchen
Filterpapier
Filterpapier Whatman 3MM
HyperfilmTM ECL-Chemilumineszenz-Film
Kolibrispitzen
Microlance® Kanülen
Nitrozellulosemembran Optitran® 0,2 µm
Nitrozellulosemembran Optitran® 0,45 µm
NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (10 Well, 1,5 mm)
NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (15 Well, 1,5 mm)
Objektträger
Parafilm®
Pasteurpipetten ungestopft
PCR-Reaktionsgefäße
Pipettenspitzen
Reaktionsgefäße (0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml)
Serologische Pipetten
Skalpell
Spektrometerküvetten
Spitzbodenplatte (96 Vertiefungen)
Spritzenvorsatzfilter 0,2 µm
Spritzenvorsatzfilter 0,45 µm
Sterilvakuumfilter 0,2 µm
Ultra-ClearTM-Zentrifugenröhrchen, 11-60 mm
Ultra-ClearTM-Zentrifugenröhrchen, 16-102 mm
Zellkulturflaschen (50, 250, 650 ml)
Zellkulturplatten (6, 12, 24, 96 Vertiefungen)
Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml)
Millipore, Darmstadt
Millipore
Greiner, Frickenhausen
Hielscher Ultrasonics, Teltow
Carl Roth
Nunc, DK
Greiner
Whatman, UK
Whatman
GE Healthcare
Kisker Biotech GmbH, Steinfurt
Becton Dickinson
GE Healthcare
GE Healthcare
Life Technologies
Life Technologies
Carl Roth
Pechiney Plastic Packaging, USA
Hecht, Sondheim
Sarstedt
Sarstedt
Sarstedt
Greiner
Feather, Osaka, Japan
Sarstedt
Nerbe plus, Winsen/Luhe
Whatman/GE Healthcare
Whatman/GE Healthcare
Millipore, Eschborn
Beckman Coulter, Krefeld
Beckman Coulter
Greiner
Nunc
Sarstedt, Nürnberg
Material und Methoden
38
3.5 Geräte
Absaugvorrichtung Filter Mate Harvester
Pipettierhilfe Accu-Jet pro
Pipettierhilfe pipetus® akku
Dokumentationsanlage Gel Imager
Agarose-Gel-Kammer Mini-Sub® Cell GT
Agarose-Gel-Kammer Wide Mini-Sub® Cell GT
CO2- Begasungsbrutschrank
DNA/RNA-Photometer Nanodrop ND-1000
Dounce-Homogenisatoren (7 und 14 ml)
Durchflußzytometer FACS Calibur
Ein- und Zwölfkanalpipetten
Elektrophoresekammer Protean® II
Entwicklungskassetten HypercassetteTM
Filmentwicklermaschine CP1000
Feinwaage A120S
Fluoreszenzmikroskop Axiovert 100
Gelelektrophorese-Kammer X Cell SureLockTM
Geltrockner
Genetic Analyser 3130
Heizblock HB-2
Heizblock Thermostat (DB2A und DB3A)
Kühl-/Gefrierkombination
Kühlzentrifuge Biofuge 15R
Magnetrührer RET basic
Laser-Scanning-Mikroskop LSM 510 Meta
Lichtmikroskop Axioskop
Lichtmikroskop Axiovert 10
Mikroplatten- Photometer 'InfiniteTM M200'
Mikrowelle
Netzgerät Power Pack 200/300
Netzgerät Power Supply 250-2
Neubauer-Zählkammer
Nukleofektionsgerät NucleofectorTM II
PCR-Maschine T Gradient
pH-Meter wtw pH 315i
Reagenzglasschüttler Vortex-Genie 2
Rollen-Mischgerät 'Assistent' RM-5
Rotator 'Rotamix'
Perkin Elmer, Dreieich
Brand, Wertheim
Hirschmann, Eberstadt
Intas, Göttingen
Bio-Rad
Bio-Rad
Forma Scientific, USA
Nanodrop Technologies, USA
Braun
BD Biosciences
Eppendorf, Hamburg
Bio-Rad
Amersham
Agfa Deutschland, Köln
Sartorius
Zeiss, Jena
Invitrogen/Life Technologies
Bio-Rad
Applied Biosystems
Wealtec, USA
Techne, Wertheim
Liebherr, Ochsenhausen
Heraeus
IKA Labortechnik, Staufen
Zeiss
Zeiss
Zeiss
Tecan, Crailsheim
Bosch, Stuttgart
Bio-Rad
Sigma Techware, München
Fischer, Frankfurt a.M.
Amaxa, Köln
Biometra, Göttingen
Hanna Instruments, Kehl a.R.
Scientific Industries, USA
Hecht, Sondheim
Heto-Holten, Wettenberg
Material und Methoden
39
Schüttelinkubator
Schütteltisch
Schüttelwasserbad
Spektrometer SmartSpecTM3000
Sterilbank 'Lamin air®'
Tischzentrifugen 5415C, 5417C, 5417R
Ultrazentrifuge XL-80
Western Blot Transfer-Tank Trans-Blot®
Western Blot Transfer-Tank Mini Trans-Blot®
Wipptisch „Rocky“
Zentrifuge AvantiTM J-25l
Zentrifuge Biofuge 15R
Zentrifuge Megafuge 1.0
Zentrifuge Varifuge 3.0R
Zentrifuge Labofuge GL
GFL, Burgwedel
IKA Labortechnik
GFL
Bio-Rad
Heraeus
Eppendorf
Beckman Coulter
Bio-Rad
Bio-Rad
Fröbel Labortechnik, Lindau
Beckman Coulter, Krefeld
Heraeus
Heraeus
Heraeus
Heraeus
Material und Methoden
40
4. Methoden
4.1 Zellbiologische Methoden
4.1.1 Zellkultur
Alle genannten Zelllinien wurden bei 37 °C in einer wasserdampfgesättigten
Atmosphäre mit 5% (v/v) CO2 kultiviert. PBMCs wurden mittels Ficoll-Hypaque-
Dichtegradientenzentrifugation isoliert und durch Zugabe des Lektins
Phytohämagglutinin (PHA, 0,5 µg/ml) polyklonal aktiviert. Drei bis vier Tage später
wurden tote Zellen durch erneute Dichtegradientenzentrifugation entfernt und die
generierten PHA-Blasten in Kulturmedium mit rIL-2 (10 U/ml) zur weiteren Expansion
kultiviert. CD4-positive T-Zellklone (12603/12632) wurden durch regelmäßige
Aktivierung mit radioaktiv-bestrahlten PBMCs und EBV-W-Zellen, sowie Zugabe von
rIL-2 (10 U/ml) und PHA (0,5 µg/ml) vermehrt. Suspensionszellen (PHA-Blasten,
CD4+-T-Zellklone 12603/12632, JE6-1, JFL39.1, EBV-W) wurden in RPMI-1640-
Zellkulturmedium mit 25 mM HEPES, 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (10×103 U und
10×103 µg/ml) und 5-10% (v/v) hitzeinaktiviertem FCS kultiviert. Die adhärente
Zelllinie HEK 293T wurde in DMEM-Zellkulturmedium mit 10% (v/v) FCS, 1% (v/v)
Penicillin/Streptomycin und 1% (v/v) L-Glutamin kultiviert. Zur Passage wurden die
Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung (0,5%/0,2% (w/v)) für 10 Minuten bei 37 °C
abgelöst, anschließend mit Medium gewaschen, geteilt und weiter kultiviert.
4.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte nach Verdünnung der Zellsuspension mit
Trypanblau-Lösung mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer. Tote Zellen werden
hierbei selektiv angefärbt, wodurch gleichzeitig eine Beurteilung der Zellvitalität
ermöglicht wird.
4.1.3 Kryokonservierung von Zellen
Für eine längerfristige Lagerung von Zellen wurden diese in flüssigem Stickstoff
konserviert. Hierbei erfolgte der Versatz von Kulturmedium mit DMSO zur
Vermeidung von Kristallbildung innerhalb der Zellen. Adhärente Zellen wurden mit
einer Dichte von 5x106 Zellen, Suspensionszellen mit einer Dichte von 20-30x106
Zellen pro ml kaltem Einfriermedium (4 °C) resuspendiert und in Kryoröhrchen
überführt. Die Zellen wurden nun vorerst bei -80 °C gelagert, bevor sie in flüssigen
Material und Methoden
41
Stickstoff (-196 °C) gelagert wurden. Zum Auftauen der Zellen wurden diese
tropfenweise zu vorgelegtem Zellkulturmedium gegeben, zweimal mit Kulturmedium
gewaschen (1400 rpm, 5 min) und die Zellen nach Bestimmung der Zellzahl und
Zellvitalität in Kulturmedium bei 37 °C kultiviert.
4.1.4 Transfektion von Zellen
4.1.4.1 Kalzium-Phosphat-Transfektion
Adhärente HEK 293T-Zellen können mittels Kalzium-Phosphat-Transfektion transient
transfiziert werden. Hierfür wurden 4x106 Zellen in 40 ml DMEM-Medium ausgesät.
Einen Tag später wurden 10-20 µg DNA mit sterilem Wasser auf ein Volumen von
1,8 ml eingestellt und mit 200 µl Kalziumchloridlösung (2,5 M) versetzt. Die Lösung
wurde anschließend unter leichtem Schütteln (800 rpm) zu 2 ml HBS-Lösung (2x)
gegeben. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte tropfenweise die
Zugabe des Gemischs zu den Zellen. Nach 18 Stunden bei 37 °C wurde die
Transfektionseffizienz überprüft, die Zellen lysiert und mittels Western Blot analysiert.
4.1.4.2 Nukleofektion
Für die Transfektion von siRNA wurden je Ansatz 5x106 PHA-Blasten (Tag 9-11)
verwendet. Die Zellen wurden in 100 µl Nukleofektionslösung (Human T Cell
Nucleofector® Kit) resuspendiert, zusammen mit 30 nM siRNA in eine
Nukleofektionsküvette überführt und mit dem Programm X-001 im NucleofectorTM II
elektroporiert. Nach Zugabe von 500 µl warmem Zellkulturmedium wurden die Zellen
gut resuspendiert und zu 1,4 ml vorgewärmtem Zellkulturmedium mit 10 U/ml rIL-2 in
12-Loch-Platten gegeben. Nach 72 Stunden bei 37 °C wurden die Zellen gezählt und
analysiert.
4.1.5 Immunfluoreszenzanalysen
4.1.5.1 Konfokale Mikroskopie
Vorbereitung der Deckgläser
Zur Vorbereitung für die Zellkultur wurden die Deckgläser 15 Minuten in
konzentrierter Salzsäure inkubiert, zweimal mit Wasser und einmal mit 70%igem
Ethanol gewaschen und anschließend über Nacht bei 180 °C getrocknet und
sterilisiert. Für die Immunfluoreszenzanalyse von Suspensionszellen wurden die
Material und Methoden
42
Deckgläser in eine sterile 12-Loch-Platte überführt, zweimal mit sterilem PBS
gewaschen und für 30 Minuten mit Poly-L-Lysin (100 µg/ml in PBS) bei 37 °C
beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden 1-2x106 Zellen auf die
vorbereiteten Deckgläser überführt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Durch
vorsichtiges Abnehmen des Kulturmediums wurden nicht-adhärente Zellen entfernt.
Die Fixierung haftender Zellen erfolgte durch Zugabe von 3% PFA in PEM-Puffer
über 5 Minuten und anschließender Inkubation mit 3% PFA in Borat-Puffer über
10 Minuten. Für Analysen intrazellulärer Proteine wurden die Zellen durch Zugabe
von 1% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten permeabilisiert. Anschließend wurden die
Zellen dreimal mit PBS gewaschen und dann zur Reduktion freier Aldehydgruppen,
was eine Reduktion der Hintergrundfärbungen bewirkt, zweimal für 10 Minuten mit
Natriumborhydrid (1 mg/ml in Wasser) inkubiert. Nach erneutem dreimaligem
Waschen mit PBS erfolgte die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit
1% BSA in PBS für eine Stunde. Die Antikörper wurden in 60 µl Blockierungslösung
entsprechend verdünnt und auf Parafilm gegeben. Anschließend wurden die Zellen
auf die vorgelegten Primärantikörper gegeben und über Nacht bei 4 °C gefärbt. Nach
zweimaligem Waschen mit PBS wurden mit direkt konjugierten Antikörpern gefärbte
Proben einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und auf Objektträger mit 14 µl
Eindeckelmedium gebracht. Hierdurch wurden die Zellkerne mit DAPI sichtbar
gemacht und die Deckgläser fixiert. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur erfolgte
die Lagerung der Proben bei 4 °C bis zur konfokalen Analyse mit dem LSM 510 (Carl
Zeiss, Jena). Die Auswertung erfolgte mittels LSM Image Explorer Software.
4.1.5.2 Durchflusszytometrie
4.1.5.2.1 Detektion von Zelloberflächenmolekülen
Durchflusszytometrische Analysen zur Detektion von Proteinen basieren auf der
Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper, die Antigene auf der Zelloberfläche
selektiv färben oder nach Permeabilisierung der Zellen auch intrazelluläre Antigene
detektieren können. In dieser Arbeit wurden lediglich Oberflächenfärbungen
durchgeführt. Hierbei wurden 2-4x105 unbehandelte oder stimulierte Zellen in
einzelne Kavitäten einer 96-Loch-Spitzbodenplatte überführt, pelletiert und einmal mit
100 µl kaltem FACS-Waschpuffer (FWP) gewaschen (1000 rpm, 2 min, 4 °C). Der
Primärantikörper bzw. die entsprechende Isotypkontrolle wurde in FWP verdünnt. Die
Zellpellets wurden in 10 µl der Antikörperlösung resuspendiert und lichtgeschützt 20-
Material und Methoden
43
45 Minuten bei 4 °C inkubiert. Bei Verwendung direkt konjugierter Primärantikörper
wurden die Zellen anschließend zweimal mit FWP gewaschen, in 100 µl 1% PFA in
PBS resuspendiert und in FACS-Röhrchen überführt. Bei Färbungen mit
unkonjugierten Primärantikörpern wurden die Zellen zweimal mit FWP gewaschen
und für 20 Minuten mit einem geeigneten Sekundärantikörper bei 4 °C im Dunkeln
inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit FWP wurden die Zellen in 100 µl 1%igem
PFA in PBS aufgenommen und in FACS-Röhrchen überführt. Bis zur Analyse am
Durchflusszytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Heidelberg) wurden die Proben
bei 4 °C lichtgeschützt gelagert. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm
CellQuestPro (BD Biosciences).
4.1.5.2.2 Zelltodanalyse mittels Propidiumiodidfärbung
Propidiumiodid (PI) durchdringt die Zellmembran toter Zellen und interkaliert in die
DNA. Diese Eigenschaft wird bei der durchflusszytometrischen Bestimmung des
Anteils toter Zellen genutzt. Die Zellen wurden vor der Färbung einmal mit kaltem
PBS gewaschen (1000 rpm, 2 min, 4 °C), das Zellpellet anschließend in 100 µl PI-
Lösung (2 µg/ml) resuspendiert und in FACS-Röhrchen überführt. Die Messung
wurde direkt im Anschluss an einem FACSCalibur (BD Biosciences) durchgeführt.
Der Wert PI-negativer, lebender Zellen wurde von 100% subtrahiert, um den Anteil
toter Zellen zu erhalten.
4.1.6 Stimulation von Zellen
Zur Stimulation von PHA-Blasten und CD4+-T-Zellen mit Phorbolester (12-O-
tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), und dem Kalziumionophor Ionomycin
wurden die Zellen in Kulturmedium mit rIL-2 und einer finalen Konzentration von
10 ng/ml TPA und 500 ng/ml Ionomycin inkubiert. Für eine Aktivierung des T-
Zellrezeptors in Suspension wurden PHA-Blasten, CD4+-T-Zellen und JFL-Zellen mit
10 µg/ml des monoklonalen Antikörpers gegen CD3 (OKT3) und dem
kreuzvernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (RaM, 1,2 µg/ml) inkubiert. Die
Zellen wurden in der Antikörpersuspension resuspendiert und 3 Minuten bei 37 °C
inkubiert. Anschließend wurden sie einmal mit PBS gewaschen und lysiert. Für
plattengebundene T-Zellrezeptorstimulation wurden 96-Loch-Platten mit 50 µl bzw.
24-Loch-Platten mit 250 µl PBS mit anti-CD3 (2 µg/ml) und anti-CD28 (5 µg/ml)
3 Stunden bei 37 °C inkubiert, zweimal mit PBS gewaschen und bis zur Stimulation,
Material und Methoden
44
aber nicht länger als über Nacht, bei 4 °C gelagert. Die Zellen wurden in einer
definierten Zellzahl in Zellkulturmedium auf die Kavitäten gegeben. Nach Ablauf der
Stimulation wurden die Überstände bei -20 °C eingefroren und die Zellen lysiert bzw.
für die Durchflusszytometrie vorbereitet.
Teilweise wurden vor der Stimulation von Zellen verschiedene Inhibitoren eingesetzt.
Für die Inhibierung von Src-Kinasen wurde der Inhibitor PP1 mit einer Konzentration
von 10 µM eingesetzt. Cholesteroldepletion erfolgte unter Einsatz von 5-10 mM
Methyl--Cyclodextrin (MbCD). Inhibierung von Palmitoylierungen wurde durch
100 µM 2-Brompalmitat (2BP) erreicht. Für die Inhibierung von Myristoylierungen
wurden 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) eingesetzt. Die Zugabe der
Inhibitoren erfolgte direkt ins Zellkulturmedium vor der Stimulation mit den
Antikörpern. Für MbCD geschah dies 30 Minuten, für PP1 1 Stunde und für 2BP bzw.
2HMA 2 Stunden vor der Stimulation mit anschließender Inkubation bei 37 °C.
4.2 Molekularbiologische Methoden
4.2.1 RNA-Isolierung
Die Isolation von RNA aus T-Zellen wurde mit dem RNeasy® Miniprep Kit nach
Herstellerprotokoll durchgeführt. 2x106 Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen,
pelletiert und anschließend in 350 µl RLT-Puffer mit 3,5 µl -Mercaptoethanol
resuspendiert. Lyse der Zellen erfolgte durch Einfrieren der Probe bei -80 °C. Nach
Zugabe von 350 µl 70%igem Ethanol wurde das Lysat auf eine Filtersäule gegeben
und zentrifugiert (10000 rpm, 15 sek). Nach einem Waschschritt mit 700 µl RW1-
Waschpuffer und zwei weiteren Waschschritten mit je 500 µl RPE-Puffer wurde die
RNA mit RNase-freiem Wasser aus der Säulenmatrix gelöst und der RNA-Gehalt
bestimmt (Nanodrop). Die RNA wurde bei -80 °C gelagert.
4.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
4.2.2.1 RT-PCR
Die Herstellung von cDNA aus RNA erfolgte mit dem First Strand cDNA Synthesis
Kit. Hierfür wurde 1 µg RNA mit 1 µl Random Hexamer Primer und RNase-freiem
Wasser auf ein Volumen von 12 µl gebracht und 5 Minuten bei 65 °C inkubiert.
Material und Methoden
45
Anschließend erfolgte die Zugabe von 4 µl 5x Reaction Buffer, 2 µl dNTP Mix
(10 mM), 1 µl RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl) und 2 µl M-MuLV Reverse
Transcriptase (20 U/µl). Die Proben wurden nun im PCR-Gerät inkubiert (5 min,
25 °C; 60 min, 37 °C; 5 min, 70 °C). Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20 °C.
4.2.2.2 Konventionelle PCR
Für die Vervielfältigung einer DNA-Sequenz aus cDNA wurde die DreamTaq-
Polymerase eingesetzt. Ein Gesamtvolumen von 20 µl ergaben sich aus 2 µl
DreamTaq-Puffer (10x), 1 µl der beiden Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer
(10 pmol/µl), 0,5 µl dNTPs (10 mM), 0,2 µl DreamTaq-Polymerase, 1 µl cDNA und
14,3 µl sterilem Wasser. Die Aktivierung der DreamTaq-Polymerase erfolgte über
3 Minuten bei 95 °C. Anschließend wurden 20-30 Zyklen zur Amplifikation der cDNA
durchgeführt mit je 30 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden mit der
Anlagerungstemperatur der Primer entsprechenden Temperatur und 30-
60 Sekunden bei 72 °C für die Elongation des Amplifikats. Nach 5 Minuten bei 72 °C
wurde die PCR beendet und die Proben bei 4 °C bis zur Analyse mittels Agarose-
Gelelektrophorese gelagert.
Für Klonierungs-PCRs wurde für eine korrekte Amplifikation der DNA-Sequenz eine
Polymerase mit Korrekturlese-Funktion, die Pfu-Polymerase, benutzt. Das
Gesamtvolumen von 50 µl setzte sich hier zusammen aus 5 µl 10x Pfu-Polymerase-
Puffer, 2,5 µl der entsprechenden Primer (10 pmol/µl), 1 µl dNTPs, 0,5 µl Pfu-
Polymerase, 2 µl cDNA und 36,5 µl sterilem Wasser. Das PCR-Programm wurde mit
3 Minuten bei 95 °C begonnen. Nach 30-35 Zyklen zur Amplifikation (30 Sekunden
bei 95 °C, 30 Sekunden bei der Primer-spezifischen Temperatur, 30-60 Sekunden
bei 72 °C) wurde die Klonierungs-PCR für 5 Minuten bei 72 °C beendet.
Für eine Überprüfung der erfolgreichen Insertion eines verdauten Amplifikats in ein
Plasmid wurden sogenannte Kolonie-PCRs durchgeführt. Hierbei wurde ein
Mastermix bestehend aus 1 µl DreamTaq-Puffer (10x), 0,4 µl Primer (3‘ und 5‘),
0,05 µl DreamTaq-Polymerase, 0,2 µl dNTPs (10 mM) und 7,95 µl Wasser je Ansatz
hergestellt. In PCR-Reaktionsgefäße wurden je 10 µl Mastermix vorgelegt und mit
einer sterilen Pipettenspitze in Einzelkolonien gepickt und in dem Mastermix
eingetaucht. Anschließend wurde das entsprechende PCR-Programm (siehe oben)
Material und Methoden
46
durchgeführt und die Proben anschließend auf eine Amplifikation der
entsprechenden DNA-Sequenz und somit positive Insertion in das Plasmid überprüft.
4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Analyse der PCR-Amplifikate bzw. Produkte eines Restriktionsverdaus wurden
Agarose-Gelelektrophoresen durchgeführt. Hierfür wurde 1-2% Agarose in TAE-
Puffer aufgekocht und mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die DNA wurde mit 10x
Ladepuffer versetzt und ihrem Molekulargewicht entsprechend aufgetrennt und unter
UV-Licht analysiert.
4.2.4 Restriktionsverdau
Das Produkt einer Klonierungs-PCR wurde mit dem QIAquick® PCR Purification Kit
(Qiagen) aufgereinigt und zusammen mit dem Zielvektor mit den jeweiligen
Restriktionsenzymen der eingebauten Schnittstellen aufgeschlossen (32 µl PCR-
Produkt bzw. 5 µg Leervektor, 3 µl NEB-Puffer, 0,5 µl der beiden Enzyme, 0,3 µl BSA
(100x), mit sterilem Wasser auf 40 µl Gesamtvolumen). Der Verdau wurde 2-
4 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschließend über Agarose-Gelelektrophorese
aufgetrennt. Die Produkte des Restriktionsverdaus wurden mit einem sterilen Skalpell
ausgeschnitten und mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) eluiert.
4.2.5 Ligation
Die Ligation von aufgeschlossenem Vektor und zu insertierender DNA erfolgte mittels
T4-DNA-Ligase. Um zu verhindern, dass sich der aufgeschlossene Vektor ohne
Insert wieder schließt, wurde der Vektor mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (SAP)
behandelt. Hierfür wurde 1 µg DNA mit 2 µl SAP-Puffer und 1 µl (1 Unit) SAP
versetzt und mit sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 µl gebracht. Nach
einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37 °C und anschließender Inaktivierung des
Enzyms über 15 Minuten bei 65 °C erfolgte die Ligation. Die zu klonierende DNA
wurde in dreifach höherer Konzentration zu 100 ng aufgeschlossenem Vektor
gegeben und mit 2 µl 10x Ligase-Puffer, 1 µl T4-Ligase und sterilem Wasser auf ein
Volumen von 20 µl gebracht und über Nacht bei 16 °C inkubiert.
Material und Methoden
47
4.2.6 Transformation hitzeschockkompetenter Bakterien
Je Transformation wurden 100 µl hitzeschockkompetente Bakterien (E. coli: DH5
bzw. BL-21) auf Eis aufgetaut und 10 µl des Ligationsproduktes bzw. 0,5-1 µg
aufgereinigte Plasmid-DNA zugegeben. Nach 30minütiger Inkubation auf Eis wurden
die Bakterien 30 Sekunden bei 42 °C und 2 Minuten auf Eis inkubiert, bevor 1 ml
Circle-Grow-Medium zugegeben wurde und die Bakterien eine Stunde bei 37 °C bei
300 rpm inkubierten. 50 µl der Bakteriensuspension wurde auf Antibiotika-haltigen
Agarplatten mit einem Drigalskispatel ausplattiert. Der Rest der Bakterien wurde
pelletiert (2000 rpm, 5 min) und der Überstand bis auf 50 µl verworfen. Die restlichen
50 µl der Bakterienlösung wurden auf einer weiteren Agarplatte mit Antibiotikum
ausgestrichen. Die Agarplatten wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert und
transformierte Antibiotika-resistente Kolonien am folgenden Tag mittels Kolonie-PCR
bzw. Restriktionsverdau analysiert.
4.2.7 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien erfolgte mittels
QIAprep® Spin Miniprep Kit bzw. QIAGEN® Plasmid Maxi Kit nach dem
Herstellerprotokoll. Für kleine Mengen wurden 3 ml LB-Medium, versetzt mit
50 µg/ml des entsprechenden Antibiotikums, in ein Schüttelröhrchen gegeben und
mit einer Einzelkolonie beimpft. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und 250 rpm über
Nacht. Nach Pelletieren der Kultur (3500 rpm, 10 min) und Verwerfen des
Überstandes wurde das Pellet in 250 µl P1-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von
250 µl P2-Puffer und 350 µl N3-Puffer mit anschließender Zentrifugation (13000 rpm,
10 min) wurde der Überstand auf eine Filtersäule gegeben. Die Säule wurde einmal
mit 750 µl PE-Puffer gewaschen und anschließend gebundene DNA mit sterilem
Wasser eluiert. Mittels Nanodrop wurde der DNA-Gehalt bestimmt.
Für die Aufreinigung großer Mengen Plasmid-DNA wurden 350 ml LB-Medium mit
Antibiotikum beimpft und über Nacht bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. Am nächsten
Tag wurde die Kultur pelletiert (6000 g, 15 min, 4 °C), der Überstand verworfen und
das Pellet in 10 ml Puffer P1 resuspendiert. Nach Zugabe von 10 ml Puffer P2,
fünfmaligem Schwenken und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten wurden
10 ml Puffer P3 zugegeben, erneut fünfmal geschwenkt und 20 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde das Lysat nach Zentrifugation
Material und Methoden
48
(13000 rpm, 15 min, 4 °C) auf mit QBT-Puffer equilibrierte Filtersäulen gegeben.
Nach Bindung der DNA wurden die Filtersäulen zweimal mit je 30 ml QC-Puffer
gewaschen und die DNA durch Zugabe von 15 ml QF-Puffer eluiert. Die Präzipitation
der DNA erfolgte durch Zugabe von 10,5 ml Isopropanol und anschließender
Zentrifugation (15000 g, 30 min, 4 °C). Das DNA-Pellet wurde zweimal mit 5 ml
70%igem Ethanol gewaschen und in je 500 µl sterilem Wasser gelöst. Die
Bestimmung des DNA-Gehalts erfolgte mittels Nanodrop-Messung.
4.2.8 Sequenzierung und Sequenzierungsanalyse
Sequenzierungen zur Analyse erfolgreicher Klonierungen bzw. zur Identifizierung von
SH3-Domänen des Phage Display Screenings wurden mit dem BigDye® Terminator
Kit v1.1 durchgeführt. Für eine Sequenzierung wurden 0,5 µg DNA mit 4 µl
Reaktionspuffer, 2 µl Reaktionsmix und 3,2 pmol eines Sequenzierungsprimers
versetzt und mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 20 µl gebracht. Der PCR-
Verlauf begann bei 96 °C für 1 Minute, anschließend erfolgten 25 Zyklen über
15 Sekunden bei 96 °C, 10 Sekunden bei 55 °C und 4 Minuten bei 60 °C. Nach
Aufreinigung der Probe mit dem DyeEx 2.0 Kit (Qiagen) erfolgte die Lagerung bei
4 °C bis zur Messung am Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems). Die Analyse
erfolgte mit der Vector NTI® 10 Software (Life Technologies).
4.2.9 Glycerolstocks
Die Lagerung transformierter Bakterien erfolgte bei -80 °C. Hierfür wurden 500 µl der
Ampicillin-selektierten Bakterienkultur mit 500 µl Glycerol vermischt und bei -80 °C
eingefroren.
4.2.10 Identifizierung interagierender SH3-Domänen mittels Phagenbibliothek
Die Transduktionskompetenz der TG1-Bakterien wurde in vorhergehenden Arbeiten
durch M13K08-Helferphagen sichergestellt (Diplomarbeit H. Oberdoerster, 2010).
Kompetente Bakterien wurden bei -80 °C gelagert. Zur Identifizierung von
potentiellen Interaktionspartnern von ADAM10 wurde eine kommerziell erhältliche
Phagenbibliothek mit allen bekannten humanen SH3-Domänen (All SH3 Domain
Phager®) verwendet. Zunächst wurden für das Kontrollprotein GST und das
Zielprotein GST-ADAM10cyt(697-748) jeweils 100 µl magnetische Beads
(Dynabeads® M-270 Epoxy) in Reaktionsgefäße überführt und dreimal mit je 100 µl
Material und Methoden
49
Natriumphosphatpuffer gewaschen. Nun erfolgte die Zugabe von 10 µg
Fusionsprotein in Natriumphosphatpuffer, kurzes Vortexen der Beads und nach der
Zugabe von 50 µl Ammoniumsulfatlösung rotierten die Beads langsam über Nacht
bei 4 °C, um eine Bindung der Proteine zu ermöglichen. Anschließend wurden die
Beads pelletiert und nach Entfernen der Proteinlösung wurden unspezifische
Bindungsstellen durch Zugabe von 200 µl Blockierungspuffer über eine Stunde bei
Raumtemperatur bei leichtem Schwenken abgedeckt. Im Anschluss wurden die
Beads dreimal mit PBS gewaschen und in 200 µl Phage-Solution, bestehend aus
100 l Blockierungspuffer und 100 l Phage Display Library Solution
(6x 1010 PFU/ml), resuspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur
wurde der Überstand abgenommen und die Beads mit Waschpuffer zehnmal
gewaschen. Nach Elution gebundener Phagen durch Zugabe von 150 µl
Elutionspuffer und 10-15 Minuten bei Raumtemperatur und leichtem Schwenken der
Beads wurde das Eluat in neue Reaktionsgefäße überführt und mit 1 M Trispuffer
(pH 9,0) neutralisiert. Mit sterilem LB-Medium wurde aus der Phagensuspension eine
Verdünnungsreihe erstellt und je 500 µl TG1-Bakterien in LB-Medium mit 5 µl der
jeweiligen Verdünnung versetzt. Die Bakterien wurden kurz zentrifugiert und
anschließend 30 Minuten ruhend bei 37 °C inkubiert. Auf Ampicillin-versetzten
SOBAG-Platten wurden je 100 µl der Lösung ausgestrichen und über Nacht bei
37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden transduzierte Klone gezählt und der Titer
bestimmt. Zur nachfolgenden Sequenzierung und Identifizierung gebundener Phagen
wurden 3 ml steriles LB-Medium mit Ampicillin mit einem Klon beimpft, über Nacht
bei 250 rpm und 37 °C inkubiert, die DNA extrahiert und mit Hilfe der
Sequenzierprimer H-305 und J-55 sequenziert. Die zwischen den Schnittstellen
BssHII und NotI befindliche Sequenz wurde translatiert und mittels Swissprot-Server
über Protein BLAST identifiziert. Von allen Klonen wurden vorsorglich Glycerolstocks
angelegt.
Material und Methoden
50
4.3 Biochemische Methoden
4.3.1 Expression und Aufreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine
Die Herstellung rekombinanter Fusionsproteine erfolgte durch heterologe Expression
in E. coli. Diese wurden zuvor mit dem Konstrukt transformiert und konnten sich
durch die erworbene Antibiotika-Resistenz in Ampicillin-enthaltendem Medium
vervielfältigen. Zur Herstellung der GST-Fusionsproteine im großen Maßstab wurden
100 ml LB-Medium mit Ampicillin mit Bakterien beimpft und über Nacht bei 37 °C und
250 rpm inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 33 ml der Vorkultur zu
300 ml frischem LB-Medium mit Ampicillin bei 37 °C für eine Stunde. Nun wurden
333 µl IPTG (100 µM) zur Induktion der Expression zugegeben und für weitere 4-
7 Stunden bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert
(5000 rpm, 10 min, 4 °C) und in 27 ml kaltem PBS resuspendiert. Der Aufschluss der
Bakterien erfolgte durch Ultraschallbehandlung (3x5 Sekunden) und Zugabe von 3 ml
10% (v/v) Triton X-100 in PBS. Nach der Lyse (30 min, auf Eis) und anschließender
Zentrifugation (13000 rpm, 4 °C) wurden die Lysate abgenommen und zu 1 ml
Glutathion-4B-Sepharosebeads gegeben (1:2 in PBS). Nach einstündiger Rotation
bei Raumtemperatur bzw. Rotation über Nacht bei 4 °C wurde das Gemisch
zentrifugiert (3500 rpm, 10 min, 4 °C), der Überstand verworfen und die Beads
dreimal mit PBS gewaschen. Nach Zugabe von 1 ml Elutionspuffer und Rotation der
Beads für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Fusionsprotein von den Beads
gelöst. Nach kurzer Zentrifugation konnte das Eluat abgenommen und der
Proteingehalt bestimmt werden. Die Elution wurde wiederholt, bis kein Fusionsprotein
im Überstand zu detektieren war. Die Eluate wurden vereinigt, auf eine Filtersäule
(Amicon® Ultra) gegeben und der Elutionspuffer durch Zentrifugation bei 2000 rpm
und 4 °C durch PBS ersetzt. Das aufgereinigte Protein wurde auf eine Konzentration
von 1 mg/ml eingestellt, sterilfiltriert und bei -80 °C gelagert. 25 µg wurden mittels
SDS-Gelelektrophorese analysiert.
Für die Expression kleiner Mengen eines Fusionsproteins wurden 3 ml LB-Medium
mit Ampicillin mit den entsprechenden Bakterien beimpft, über Nacht bei 37 °C und
250 rpm inkubiert und anschließend 4,5 ml frisches LB-Medium mit Ampicillin mit
500 µl der Vorkultur beimpft. Nach einer Stunde bei 37 °C und 250 rpm wurden 5 µl
IPTG (100 µM) zugesetzt und weitere 4-5 Stunden inkubiert (37 °C, 250 rpm). Die
Bakterien wurden pelletiert, in 0,9 ml kaltem PBS resuspendiert und durch
Material und Methoden
51
Ultraschallbehandlung (2x3 sek) und Zugabe von 100 µl 10% (v/v) Triton X-100 in
PBS aufgeschlossen (30 min, auf Eis). Nach Zentrifugieren (13000 rpm, 10 min,
4 °C) wurden die Überstände zu je 30 µl Glutathion-4B-Sepharosebeads (1:2 in PBS)
gegeben und 10-20 Minuten bei Raumtemperatur rotiert. Die Beads wurden dreimal
mit PBS gewaschen, mit PBS und Probenpuffer versetzt und 5 Minuten bei 100 °C
denaturiert. Die Analyse erfolgte mittels SDS-Gelelektrophorese und anschließender
Coomassie-Färbung.
4.3.2 Herstellung von Zelllysaten und Bestimmung des Proteingehalts
Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und das Zellpellet anschließend in
1% (v/v) NP-40 Lysepuffer, versetzt mit Proteaseinhibitoren (1 mM AEBSF, 2 µg/ml
Aprotinin, 2 µg/ml Leupeptin, 2 µg/ml Pepstatin A) und gegebenenfalls
Phosphataseinhibitoren (1 mM Natriumorthovanadate, 10 mM Natriumfluorid, 1 mM
Natriumpyrophosphat) resuspendiert. Nach 20minütiger Lyse auf Eis wurden
Zellrückstände pelletiert (14000 rpm, 10 min, 4 °C), Lysate abgenommen und
eventuell der Proteingehalt des Lysats mittels Bradford-Test photometrisch bestimmt.
4.3.3 Detektion von löslichem FasL in Zellkulturüberständen (ELISA)
Löslicher FasL in Zellkulturüberständen wurde mittels „Enzyme Linked
Immunosorbent Assay“ (ELISA) quantitativ bestimmt (Human FasL DuoSet). Die
Durchführung erfolgte nach Anleitung des Herstellers. Die densitometrische
Auswertung erfolgte mit einem Infinite® M200 Microplate Reader bei einer
Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 540 nm.
4.3.4 Pull-Down mit rekombinanten GST-Fusionsproteinen
Die Verifizierung von Protein-Protein-Interaktionen kann über die Verwendung von
GST-Fusionsproteinen mittels Pull-Down erfolgen. Hierfür wurden Zelllysate auf
Glutathion-4B-Sepharosebeads (1:2 in NP-40-Puffer), versetzt mit 10-25 µg eines
GST-Fusionsproteins, gegeben und 2 Stunden bei 4 °C rotiert. Nach Zentrifugation
wurden die Beads fünfmal mit NP-40-Puffer ohne Inhibitoren und zweimal mit PBS
gewaschen. Anschließend wurden die Beads mit einer Kanüle (27 Gauge)
trockengesaugt, mit Wasser und Probenpuffer versetzt und für die Analyse über
SDS-Gelelektrophorese vorbereitet.
Material und Methoden
52
4.3.5 Immunpräzipitation
Die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen kann weiterhin über (Co-)
Immunpräzipitationen erfolgen. Lysate wurden auf Protein-G-Sepharosebeads (1:2 in
NP-40-Puffer), versetzt mit 1-2 µg des entsprechenden Antikörpers, gegeben und
2 Stunden bei 4 °C rotiert. Die Beads wurden fünfmal mit Lysepuffer (ohne
Inhibitoren) und zweimal mit PBS gewaschen, bevor sie mit einer Kanüle
trockengesaugt und für die Analyse über SDS-Gelelektrophorese vorbereitet wurden.
4.3.6 Isolation sekretorischer Granula
Die Extraktion sekretorischer Lysosomen wurde mit Hilfe des Lysosome Isolation Kits
durchgeführt. Vorhergehenden Protokollen der Arbeitsgruppe entsprechend wurden
5-8x108 PHA-Blasten (unstimuliert oder mit anti-CD3 aktiviert) einmal mit kaltem PBS
gewaschen und das Volumen des Pellets abgeschätzt. Nach erneuter Zentrifugation
(1400 rpm, 5 min) wurden die Zellen in dem 2,7fachen Volumen Extraktionspuffer mit
Protease- und Phosphataseinhibitoren resuspendiert. Durch 30-40 Stöße in einem
Dounce-Homogenisator wurden die Zellen aufgeschlossen und der Aufschluss
mittels Trypanblau-Färbung überprüft. Bei 80-90% Zelltod wurde die Zellsuspension
in Reaktionsgefäße überführt und Zellorganellen durch differentielle Zentrifugation
angereichert. Nach einem ersten Zentrifugationsschritt (1000 g, 10 min, 4 °C) wurde
der Überstand in ein neues Gefäß überführt und erneut zentrifugiert (20000 g,
20 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Extraktionspuffer
resuspendiert und auf einen Gehalt von 19% (v/v) OptiPrepTM eingestellt.
Anschließend wurde ein diskontinuierlicher Gradient hergestellt. Auf den Boden des
Zentrifugenröhrchens wurden 0,4 ml 27% OptiPrepTM gegeben und mit 0,7 ml 22,5%,
0,9 ml 19% (enthielt die Probe), 0,7 ml 16%, 0,8 ml 12% und 0,9 ml 8%
OptiPrepTM (v/v) überlagert. Der Gradient wurde nun 5 Stunden bei 148000 g bei
4 °C zentrifugiert (ohne Bremse, Rotor SW60Ti). Letztlich wurden 6 Fraktionen
abgenommen, der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen bestimmt und je 4 µg
Protein über Gelelektrophorese aufgetrennt (Bis-Tris NuPAGE®).
4.3.7 Isolation Detergenz-resistenter Membranen
Für die Isolation Detergenz-resistenter Membranen wurden Zellen (je Ansatz
100x106 PHA-Blasten bzw. 80x106 Jurkat-Zellen) unbehandelt inkubiert bzw. mit
verschiedenen Inhibitoren vorbehandelt. Anschließend wurden sie in reinem
Material und Methoden
53
Zellkulturmedium oder in Zellkulturmedium versetzt mit einem monoklonalen
Antikörper gegen CD3 und einem quervernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper
inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen in 1 ml TNE-
Puffer (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,5) mit 1% Triton X-100 und
Protease- sowie Phosphataseinhibitoren lysiert. Nach fünf-zehnfachem Drücken
durch eine 27G-Kanüle wurde das Lysat mit 1 ml 85%iger Sucrose in TNE-Puffer
gemischt und auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens gegeben. Nun wurde
das Lysat mit 6 ml 30%iger Sucrose und 5%iger Sucrose in TNE-Puffer
überschichtet. Nach dem Überlagern mit 2 ml TNE-Puffer wurde der Gradient 14-
18 Stunden bei 29000 rpm und 4 °C ohne Bremse zentrifugiert (Rotor SW32Ti).
14 Fraktionen à 1 ml wurden von oben nach unten abgenommen und je 20 µl mittels
Western Blot analysiert.
4.3.8 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht erfolgt durch die SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese, bei der die Proteine zuerst durch
Sodiumdodecylsulfat (SDS) denaturiert und negativ geladen werden. Durch die
mögliche Zugabe von -Mercaptoethanol im Probenpuffer werden Disulfidbrücken
gespalten und die Probe reduziert. Die Auftrennung erfolgte entweder mit dem
Protean II-System oder mit dem NuPAGE®-System. Bei dem Protean II-System von
Bio-Rad wurden je nach gewünschter Auftrennung 10-15% Acrylamidgehalt des
Trenngels verwendet. Nach Überschichtung des Trenngels mit 96%igem Ethanol für
eine ebene Trennlinie und vollständiger Polymerisierung wurde das Ethanol
verworfen, dreimal mit destilliertem Wasser gespült und das Sammelgel darüber
gegossen. Der Probenkamm wurde eingesetzt und eine Polymerisation abgewartet.
Pro Probe wurden 25-50 µg Protein bzw. 1,5-2,5x106 Zellen eingesetzt. Die Proben
wurden mit einem Drittel reduzierendem Probenpuffer versetzt und erhitzt (5 min,
95 °C). Anschließend wurden die Proben mit Kolibrispitzen in die mit Laufpuffer
gefüllten Geltaschen pipettiert. Nach Auffüllen der inneren Kammer mit Laufpuffer
erfolgte die Auftrennung der Proteine bei 60-80 V über Nacht. Bei dem NuPAGE®-
System wurden 4-12% Bis-Tris-Fertiggele in einem MES-Puffersystem verwendet. 5-
10 µg der Probe bzw. 20 µl der Fraktionen eines Sucrosegradienten wurden mit
einem Drittel des Probenpuffers versetzt (reduzierend oder nicht-reduzierend) und
bei 95 °C für 5 Minuten inkubiert. Die Proben wurden vorsichtig in die gespülten
Material und Methoden
54
Geltaschen gegeben und der Gellauf erfolgte bei 200 V für 50-55 Minuten. Der
Gellauf wurde gestoppt, wenn die Lauffront das untere Ende des Gels erreicht hatte.
4.3.9 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen
Für eine Coomassie-Färbung aufgetrennter Proteine in einem Polyacrylamidgel
wurde das Gel nach dem Gellauf mit destilliertem Wasser gespült und eine Stunde
bei Raumtemperatur mit Coomassie-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurde das
Gel über Nacht mit Coomassie-Entfärbelösung geschwenkt und entfärbt. Das Gel
wurde nachfolgend gescannt bzw. getrocknet.
4.3.10 Western Blot
Im Anschluss an die Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Gelelektrophorese
wurden die Proteine auf Nitrozellulosemembranen (0,2 µm bzw. 0,45 µm
Porengröße) transferiert. Dies erfolgte unter Verwendung der Trans-Blot-Kammern
bei 4 °C und 0,8 A für 2 Stunden bei dem Protean II-System bzw. mit kleinen
Gelkassetten bei 100 V über eine Stunde mit Eiskühlung bei dem NuPAGE-System.
Alle Komponenten des Transfers wurden vorerst in Transferpuffer equilibriert. Der
Zusammenbau erfolgte von der Kathode zur Anode wie folgt: ein Schwamm, zwei
Whatman-Papiere, Gel, Nitrozellulosemembran, zwei Whatman-Papiere und ein
Schwamm. Nach dem Transfer wurde die Membran mit Wasser gespült und zur
Überprüfung der Transfereffizienz reversibel mit Ponceau S gefärbt. Nach der
Entfärbung der Membran mit TBS und anschließender Blockierung unspezifischer
Bindungsstellen mit 5% BSA in TBS-T bzw. 5% Milchpulver in TBS-T über eine
Stunde bei Raumtemperatur wurde die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur
oder über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper, verdünnt in TBS-T, inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit TBS-T wurde die Nitrozellulosemembran mit einem
HRP-konjugierten Sekundärantikörper, ebenfalls verdünnt in TBS-T, für 45-
60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an dreimaliges Waschen
der Membran mit TBS-T wurden markierte Proteine durch Schwenken der Membran
in ECL-Detektionsreagenz und nachfolgender Belichtung von Hyperfilm-ECL-Filmen
detektiert.
Ergebnisse
55
5. Ergebnisse
5.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden
5.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10
Phorbolester (TPA) und Kalziumionophor (Ionomycin) werden oft verwendet, um die
Aktivität von ADAM10 und ADAM17 zu steigern und die Proteolyse ihrer Substrate zu
induzieren. In der vorliegenden Arbeit sollte zunächst untersucht werden, welche der
beiden Stimuli für die ADAM10-vermittelte Proteolyse des FasL verantwortlich ist und
ob bei einer Stimulation Änderungen der Oberflächendichte von membranständigem
ADAM10 (mADAM10) auftreten. In vorhergehenden Arbeiten innerhalb der
Arbeitsgruppe (Diplomarbeit A. Schröder, 2012) konnte gezeigt werden, dass
ADAM10 auf allen getesteten T-Zellpopulationen und Tumorzelllinien in hoher Dichte
exprimiert ist. Die Stimulation mit TPA/Ionomycin hatte bei den meisten Zelllinien
keinen signifikanten Einfluss auf die Oberflächenexpression von ADAM10, die über
drei Stunden nahezu konstant blieb (Ebsen et al., 2013). Lediglich bei der Stimulation
von PHA-Blasten und frisch isolierten T-Zellen fiel auf, dass die
Oberflächenexpression von ADAM10 im Verlauf der Zeit leicht, aber kontinuierlich
abfiel. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden basierend auf den Vorbefunden
erneut PHA-Blasten mit TPA/Ionomycin stimuliert und membranständiges ADAM10
durchflusszytometrisch analysiert (Abbildung 5.1).
Abb. 5.1: Kinetik der ADAM10-Oberflächenexpression auf TPA/Ionomycin-stimulierten PHA-Blasten. Die Zellen wurden nach den angegebenen Zeitpunkten mit einem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10 (AD214Y) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert.
0
100
200
300
400
500
600
0 10 30 60 90 120 150 180
TPA/Ionomycin [min]
mADAM10
Flu
ore
sze
nzin
ten
sit
ät
(x g
eo
mea
n)
Ergebnisse
56
Auf unstimulierten PHA-Blasten war ADAM10 hoch exprimiert (geo mean: 503,88).
Zehn Minuten nach Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) über TPA und
Kalziumeinstrom durch Ionomycin stieg die Expression leicht an (geo mean: 528,34)
und nahm im Verlauf der dreistündigen Stimulation langsam ab (geo mean
180 Minuten: 388,46; Abbildung 5.1). Eine ähnliche Reduktion von ADAM10 auf
Gesamtproteinebene konnte auch mittels Western Blot-Analyse nachgewiesen
werden. Auch hier war in Zelllysaten stimulierter PHA-Blasten nach drei Stunden eine
leichte Abnahme der reifen Form von ADAM10 (60 kDa) festzustellen, während die
Ladekontrolle GAPDH konstant blieb (Abbildung 5.2). Als Kontrolle der Spezifität des
ADAM10-Antikörpers diente Lysat von Zellen, in denen ADAM10 durch siRNA-
Transfektion herunterreguliert war.
Abb. 5.2: Expression von ADAM10 nach TPA/Ionomycin-Stimulation. PHA-Blasten wurden zu den angegebenen Zeitpunkten stimuliert, anschließend lysiert und die Zelllysate elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers (11G2) konnte endogenes ADAM10 detektiert werden (oben).Die densitometrische Auswertung des Western Blots ist in der mittleren Teil der Abbildung dargestellt. Das Lysat siRNA-transfizierter Zellen wurde als Kontrolle der Spezifität aufgetrennt. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert (unten).
Ergebnisse
57
Um zu untersuchen, ob die leicht verringerte ADAM10-Expression während der
Stimulation mit TPA/Ionomycin einen Einfluss auf das FasL-Shedding hat, wurde
einerseits die Oberflächendichte des FasL auf PHA-Blasten durchflusszytometrisch
analysiert und andererseits die Generierung des löslichen FasL mittels ELISA zur
Beurteilung der proteolytischen Aktivität untersucht. Mit einem direkt-markierten
monoklonalen Antikörper, der den extrazellulären Teil des FasL erkennt, konnte ein
rapider Anstieg der Oberflächenexpression des FasL innerhalb der ersten zehn
Minuten der Stimulation detektiert werden (Abbildung 5.3). Anschließend sank die
FasL-Expression wieder ab, um nach 90 Minuten erneut anzusteigen. Dies entspricht
der zuvor innerhalb der Arbeitsgruppe beschriebenen Kinetik der FasL-Expression
auf der Oberfläche nach TPA/Ionomycin-Stimulation (Lettau et al., 2004).
Abb. 5.3: Kinetik der TPA/Ionomycin-induzierten FasL-Oberflächenexpression. PHA-Blasten wurden mit TPA und Ionomycin stimuliert und nach den angegebenen Zeitpunkten mit einem monoklonalen Antikörper gegen den FasL gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert.
Die Detektion des löslichen FasL (soluble FasL, sFasL) in den Zellkulturüberständen
der mit TPA/Ionomycin-stimulierten PHA-Blasten ergab eine kontinuierlich steigende
Menge an löslichem FasL über die Inkubationszeit von drei Stunden (Abbildung 5.4).
0
3
6
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0 30 60 90 120 150 180
Flu
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sze
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ten
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)
TPA/Ionomycin [min]
mFasL
Ergebnisse
58
Abb. 5.4: TPA/Ionomycin-induzierte Proteolyse des FasL führt zur Generation des löslichen Fragments (sFasL). PHA-Blasten wurden über die angegebenen Zeitpunkte mit TPA und Ionomycin stimuliert. sFasL wurde in den Überständen quantitativ mittels ELISA analysiert. Die angegebenen Werte entsprechen den Durchschnittswerten von Triplikaten mit Standardabweichung.
Nachfolgend sollte untersucht werden, welche der beiden Stimuli die Aktivierung von
ADAM10 bewirkt und wie sie sich einzeln oder in Kombination auf die ADAM10- und
FasL-Oberflächenexpression auswirken. Aus diesem Grund wurden PHA-Blasten
entweder mit TPA, mit Ionomycin oder der Kombination beider Faktoren im
Zellkulturmedium inkubiert. Die Oberflächenexpression von ADAM10 wurde mit Hilfe
des monoklonalen Antikörpers AD214Y analysiert (Abbildung 5.5).
Abb. 5.5: Unterschiede der ADAM10-Oberflächenexpression nach Stimulation von PHA-Blasten mit TPA, Ionomycin oder TPA/Ionomycin. Die Zellen wurden entweder mit TPA, mit Ionomycin oder TPA in Kombination mit Ionomycin über die angegebenen Zeiträume stimuliert und anschließend mit einem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10 (AD214Y) durchflusszytometrisch analysiert.
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0,1
0,2
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m/5
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)
TPA/Ionomycin [min]
sFasL
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0 30 60 90 120 150 180[min]
TPAIonomycinTPA/Ionomycin
mADAM10
Flu
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sze
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ten
sit
ät
(x g
eo
mea
n)
Ergebnisse
59
Während TPA nach 10 Minuten einen leichten Anstieg von membranständigem
ADAM10 auf der Zelloberfläche bewirkte, der anschließend wieder abfiel und sich
dann auf einem konstanten Level einpendelte, blieb bei der Stimulation mit
Ionomycin die Höhe an membranständigen ADAM10 über drei Stunden nahezu
konstant. Nur der Einsatz beider Agentien resultierte in der zuvor beschriebenen
langsamen und stetigen Reduktion von ADAM10 auf der Oberfläche (Abbildung 5.5).
Zu bemerken ist, dass bei diesem Versuch im Vergleich zu den sonstigen
Abbildungen Isotypkontrollen einer anderen Firma verwendet wurden. Obwohl die
Konzentrationen von Isotypkontrolle und spezifischen ADAM10-Antikörpern
angeglichen wurden, traten bei Verwendung verschiedener Isotypen Unterschiede
bezüglich der berechneten Fluoreszenzintensitäten auf.
Gleichzeitig zu ADAM10 wurde mit einem direkt-konjugierten FasL-Antikörper die
Dichte an FasL auf der Oberfläche gemessen. Das biphasische Expressionsprofil
war sowohl bei Ionomycin allein, als auch bei der Kombination aus TPA und
Ionomycin ausgeprägt, wobei die Inkubation mit Ionomycin eine relativ etwas
geringere FasL-Expression zur Folge hatte. Die Behandlung mit TPA führte nach 10
Minuten zu einem kurzen Anstieg des FasL, anschließend blieb die Expression auf
der Zelloberfläche über die Dauer der Stimulation konstant (Abbildung 5.6).
Abb. 5.6: TPA/Ionomycin-induzierter Verlauf der FasL-Oberflächenexpression. PHA-Blasten wurden entweder mit TPA, Ionomycin oder TPA in Kombination mit Ionomycin stimuliert und nach den angegebenen Zeitpunkten mit einem direkt-markierten monoklonalen Antikörper gegen den FasL durchflusszytometrisch analysiert.
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0 30 60 90 120 150 180[min]
TPA
Ionomycin
TPA/Ionomycin
mFasL
Flu
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sze
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(x g
eo
mea
n)
Ergebnisse
60
Die Analyse der Zellkulturüberstände mittels ELISA ergab eine nur geringe Induktion
der FasL-Proteolyse nach Stimulation mit TPA, während Inkubation mit Ionomycin zu
einem leichten Anstieg des löslichen FasL führte (Abbildung 5.7). Die Kombination
von TPA und Ionomycin dagegen resultierte in einer starken Akkumulation von
löslichem FasL in den Überständen.
Abb. 5.7: Induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden über die angegebenen Zeitpunkte mit TPA oder Ionomycin oder beidem in Kombination stimuliert. Löslicher FasL (sFasL) wurde in den Überständen quantitativ mittels ELISA analysiert. Gezeigt sind die Durchschnittswerte von Triplikaten mit Standardabweichung.
Bezüglich ADAM17 konnte innerhalb der Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die
konstitutive Oberflächenexpression dieser Protease auf Tumorzellen und
verschiedenen T-Zellen verglichen mit ADAM10 sehr gering war. Es wurde allerdings
festgestellt, dass die ADAM17-Expression auf verschiedenen T-Zellpopulationen
nach zehnminütiger Stimulation mit TPA/Ionomycin transient anstieg (Diplomarbeit A.
Schröder; Ebsen et al., 2013). Dieser Anstieg wurde in abgeschwächter Form auch
dann beobachtet, wenn TPA allein eingesetzt wurde, jedoch nur bei der Kombination
aus TPA und Ionomycin kam es zu dem deutlichen Anstieg. Dieser konnte durch
pharmakologische Inhibitoren der Aktin-Polymerisation (Latrunculin A, Cytochalasin
D) inhibiert werden, nicht jedoch durch Inhibierung der Proteinbiosynthese
(Cycloheximid) oder des Proteintransports (Brefeldin A, Monensin) (Ebsen et al.,
2013). Um zu überprüfen, ob Herunterregulation von ADAM17 den Anstieg
verhindert, wurden PHA-Blasten im Rahmen der vorliegenden Arbeit transient mit
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0 10 30 60 90 120 150 180
OD
(45
0 n
m/5
40
nm
)
[min]
TPA
Ionomycin
TPA/Ionomycin
sFasL
Ergebnisse
61
siRNA gegen ADAM17 transfiziert. Bei Stimulation mit TPA/Ionomycin zeigten diese
Zellen nur eine leichte Erhöhung von ADAM17 auf der Zelloberfläche nach
10 Minuten (Abbildung 5.8). Mit Kontroll-RNA transfizierte Zellen (scrRNA) zeigten
eine leicht verringerte Induktion von ADAM17 auf der Oberfläche verglichen mit
untransfizierten Zellen, während mit der Positivkontrolle (siRNA GAPDH) transfizierte
PHA-Blasten sogar höhere induzierte Expressionslevel an ADAM17 aufwiesen.
Abb. 5.8: Transfektion von PHA-Blasten mit siRNA gegen ADAM17 reduziert induzierbaren Anstieg der ADAM17-Oberflächenexpression nach TPA/Ionomycin-Stimulation. Zellen wurden transient mit siRNAs transfiziert oder untransfiziert inkubiert. 72 Stunden später wurden sie mit TPA/Ionomycin zur angegebenen Zeit stimuliert und durchflusszytometrisch mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ADAM17 (A300E) analysiert.
Die erfolgreiche Herunterregulation von ADAM17 wurde mittels Western Blot
überprüft. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes ADAM17 (A318)
wurde gezeigt, dass ADAM17 spezifisch herunterreguliert war und nur in den
Kontrollen (untransfiziert bzw. Positiv- (siRNA GAPDH) und Negativkontrollen
(scrRNA ADAM17)) detektiert werden konnte, nicht jedoch in Zellen, die mit siRNA
gegen ADAM17 transfiziert wurden (Abbildung 5.9).
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0 30 60 90 120 150 180
Flu
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)
TPA/Ionomycin [min]
untransfiziert
siRNA GAPDH
scrRNA ADAM17
siRNA ADAM17
mADAM17
Ergebnisse
62
Abb. 5.9: Die Herunterregulation von ADAM17 in PHA-Blasten mittels spezifischer siRNA. Zellen wurden transient transfiziert, 72 Stunden später lysiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes ADAM17 (A318) wurde die Proteinexpression von ADAM17 analysiert.
5.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter
Proteolyse
Da bisherige Analysen zur Identifizierung der verantwortlichen Protease des FasL-
Sheddings im Wesentlichen auf der Verwendung mehr oder weniger spezifischer
Inhibitoren basierten, sollte über die spezifische Herunterregulation von ADAM10 und
ADAM17 durch siRNAs überprüft werden, ob ADAM10 die wichtigste Protease im
Kontext des FasL-Sheddings ist. PHA-Blasten wurden mit einer Kombination aus drei
verschiedenen siRNAs gegen ADAM10 bzw. ADAM17 transient transfiziert. Als
Kontrollen wurden untransfizierte bzw. Kontroll-RNA-transfizierte PHA-Blasten
verwendet. 72 Stunden später wurden die Zellen mit TPA/Ionomycin stimuliert und
mittels Western Blot und ELISA die proteolytische Prozessierung des FasL
analysiert. Außerdem wurden Zelllysate auf die effektive Herunterregulation von
ADAM10 (Abbildung 5.10) bzw. ADAM17 (Abbildung 5.9) überprüft. In der
durchflusszytometrischen Analyse der ADAM10-Expression (Abbildung 5.10A) wurde
eine starke Reduktion von ADAM10 in siADAM10-transfizierten Zellen detektiert (geo
mean 33,75), verglichen mit untransfizierten Zellen (geo mean 125,99), während die
Negativkontrolle (scrRNA ADAM10), sowie mit ADAM17-siRNA-transfizierte Zellen
Ergebnisse
63
sogar leicht erhöhte Level ADAM10 aufwiesen (geo mean 147,06 bzw. 138,28). In
den Zelllysaten war sowohl die reife als auch die unreife Form von ADAM10 in
ADAM10-siRNA-transfizierten Zellen nicht mehr detektierbar, während die
Transfektion mit Positiv- (siRNA GAPDH) und Negativkontrolle (scrRNA ADAM10)
keinen Einfluss auf die Expression von ADAM10 zeigte (Abbildung 5.10B). Lediglich
bei der Transfektion von spezifisch gegen ADAM17 gerichteten siRNAs (siRNA
ADAM17) wurde bei Betrachtung des Gesamtproteingehalts ein geringer Einfluss auf
die Proteinexpression von ADAM10 deutlich (Abbildung 5.10B).
Abb. 5.10: Reduktion von endogenem ADAM10 durch transiente Transfektion mit spezifischer siRNA. (A) Die Effizienz der Herunterregulation durch ADAM10-spezifische siRNAs wurde durchflusszytometrisch mit einem monoklonalen Antikörper (AD214Y) analysiert (a, Isotypkontrolle; b, siRNA ADAM10; c, untransfizierte Zellen; d, Negativkontrolle scrRNA ADAM10; e, siRNA ADAM17). (B) Zusätzlich wurde die Reduktion von reifem (~60 kDa) und unreifem (~80 kDa) ADAM10 in ADAM10-spezifisch transfizierten PHA-Blasten auch über eine Western Blot-Analyse in Zelllysaten von untransfizierten bzw. siRNA-transfizierten Zellen nachgewiesen.
Die Analyse von löslichem FasL in Zellkulturüberständen mittels ELISA ließ deutlich
erkennen, dass sich die Herunterregulation von ADAM10 negativ auf die
proteolytische Prozessierung des FasL nach Stimulation mit TPA/Ionomycin auswirkt
und die Zellen die geringsten Mengen löslichen FasL produzierten (Abbildung 5.11).
Auch die Transfektion der Zellen mit der Kontroll-RNA (scrRNA) und siRNA gegen
ADAM17 bewirkte eine leichte Reduktion der FasL-Proteolyse, verglichen mit den
untransfizierten Kontrollzellen. Dies lag jedoch an der Transfektionsprozedur, wobei
Ergebnisse
64
nur die Herunterregulation von ADAM10 die Bildung von löslichem FasL spezifisch
verringerte (Abbildung 5.11).
Abb. 5.11: Die Herunterregulation von ADAM10 mittels siRNA reduziert die TPA/Ionomycin-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden nicht oder transient mit siRNAs gegen ADAM10 oder ADAM17 bzw. Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert und nach 72 Stunden mit TPA/Ionomycin stimuliert. In den Zellkulturüberständen wurden die Mengen löslichen FasL mittels ELISA quantifiziert. Gezeigt sind die Durchschnittswerte von Triplikaten mit Standardabweichung.
Die proteolytische Prozessierung des FasL nach Transfektion mit ADAM10-
spezifischer siRNA bzw. Kontroll-RNA und anschließender TPA/Ionomycin-
Stimulation wurde zusätzlich mittels Western Blot analysiert. In Zellen, die mit der
Negativkontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert wurden, zeigte sich nach
60 Minuten ein Anstieg des unprozessierten FasL mit einem Molekulargewicht von
circa 38 kDa. Die größten Mengen wurden bereits nach 90 Minuten Stimulation
beobachtet (Abbildung 5.12). Nach 90-120 Minuten sah man die Akkumulation des
N-terminalen Fragments (NTFs) auf einer Höhe von 15 kDa. Bei Zellen, die mit
ADAM10-siRNA transfiziert wurden, konnte nach 60-90 Minuten ebenfalls ein Anstieg
des ungespaltenen FasL detektiert werden. Bei anhaltender Stimulation akkumulierte
der FasL zunehmend und nach 180 Minuten wurde hier die größte Menge detektiert
(Abbildung 5.12). Auch in den mit siRNA gegen ADAM10 transfizierten Zellen konnte
nach 60-90 Minuten die Generation von NTFs beobachtet werden, allerdings zu
einem geringeren Ausmaß als in den Kontrollzellen (Abbildung 5.12).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
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0,6
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0 10 30 60 90 120 150 180
OD
(45
0 n
m/5
40
nm
)
TPA/Ionomycin [min]
untransfiziert
scrRNA ADAM10
siRNA ADAM10
siRNA ADAM17
sFasL
Ergebnisse
65
Abb. 5.12: Transfektion mit siRNA gegen ADAM10 reduziert die Proteolyse des FasL. Um den Einfluss von ADAM10 auf die proteolytische Prozessierung des FasL zu untersuchen, wurden PHA-Blasten mit Kontroll-siRNA (scrRNA ADAM10) bzw. spezifisch gegen ADAM10 gerichtete siRNAs transfiziert, 72 Stunden später mit TPA/Ionomycin stimuliert und anschließend mittels Western Blot analysiert. Der FasL wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne detektiert (FasLcytoII; oben). Die effiziente Herunterregulation wurde durch Inkubation der Membran mit einem polyklonalen ADAM10-Antiserum (Tier 1) überprüft (Mitte). Die reversible Färbung mit Ponceau S zeigte eine einheitliche Beladung an Gesamtprotein (unten). Abkürzungen: VL, volle Länge; NTF, N-terminales Fragment.
Da über Inhibitoren für die weitere Proteolyse der FasL-NTFs in der Plasmamembran
eine mögliche Beteiligung der Protease SPPL2a (signal peptide peptidase like 2a)
gezeigt wurde, wurden zur Verifizierung PHA-Blasten mit spezifischen siRNAs gegen
das Protein transfiziert. Als Kontrolle wurden Zellen mit Kontroll-RNA transfiziert und
mittels Western Blot analysiert (Abbildung 5.13). Im Vergleich zu Zellen, die mit
Ergebnisse
66
Kontroll-RNA transfiziert wurden (scrRNA SPPL2a), zeigten siRNA-transfizierte
Zellen, bei denen SPPL2a herunterreguliert war (siRNA SPPL2a), eine deutliche
Akkumulation von NTFs.
Abb. 5.13: Die Herunterregulation von SPPL2a resultiert in einer Akkumulation des N-terminalen Fragments des FasL. Um den Einfluss von SPPL2a auf die proteolytische Prozessierung des FasL zu untersuchen, wurden PHA-Blasten mit Kontroll-siRNA (scrRNA SPPL2a) bzw. spezifisch gegen SPPL2a gerichtete siRNA transfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit TPA/Ionomycin stimuliert, zu den angegebenen Zeitpunkten lysiert und mittels Western Blot analysiert. Der FasL wurde mit einem polyklonalen Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne detektiert (FasL N20; oben). Abkürzungen: VL, volle Länge; NTF, N-terminales Fragment.
5.1.3 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL
Eine Stimulation von Zellen mit TPA und Ionomycin wird häufig zur Induktion der
proteolytischen Aktivität von ADAM-Proteasen verwendet. Allerdings umgehen diese
beiden Stimuli physiologische Mechanismen und führen in der Zelle zu einer Vielzahl
von Reaktionen und Signalkaskaden, die nach wie vor vielfach unzureichend
verstanden sind. Deshalb sollte im Hinblick auf die induzierbare FasL-Proteolyse in
T-Zellen analysiert werden, ob auch die Aktivierung des T-Zellrezeptors (TZR) zu
einer Verstärkung des FasL-Sheddings führt. Eine Aktivierung des TZR/CD3-
Ergebnisse
67
Komplexes kann durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (OKT3) erreicht
werden, der an die TZR-assoziierte CD3ε-Untereinheit bindet und zur Auslösung der
TZR-CD3-abhängigen Signalkaskade führt (Signal 1). Als zusätzlicher Stimulus
wurde ein monoklonaler Antikörper gegen CD28 verwendet. CD28 ist ebenfalls auf T-
Zellen exprimiert und Bindung des Antikörpers bzw. der natürlichen Liganden
(CD80/CD86) führt zur Auslösung eines zweiten Signals, welches essentiell für die
vollständige Aktivierung ruhender T-Zellen ist (Signal 2). PHA-Blasten (Tag 14)
wurden über drei Stunden mit immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und CD28
stimuliert. Anschließend wurden die Zellkulturüberstände für eine Untersuchung der
Mengen an löslichem FasL mittels ELISA abgenommen. Die Zellen wurden lysiert
und elektrophoretisch aufgetrennt. Als Kontrolle dienten PHA-Blasten, die parallel mit
TPA/Ionomycin stimuliert wurden. Wie erwartet, konnten in Lysaten der Kontrollzellen
nach 120-180 Minuten Stimulation mit TPA und Ionomycin deutlich FasL-NTFs bei
15 kDa nachgewiesen werden. Die Akkumulation von NTFs wurde wenngleich in
einem etwas geringeren Ausmaß auch bei der Aktivierung über CD3 und CD28
sichtbar (Abbildung 5.14).
Abb. 5.14: Stimulation von aktivierten T-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28 resultiert in verstärkter Proteolyse des FasL. PHA-Blasten (Tag 14) wurden über einen Zeitraum von 0-180 Minuten entweder mit TPA/Ionomycin oder immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und CD28 stimuliert, lysiert und anschließend mittels Western Blot analysiert. Durch Inkubation der Nitrozellulosemembran mit einem polyklonalen Antikörper gegen den intrazellulären Teil des FasL (N20) wurden N-terminale Fragmente des FasL detektiert. GAPDH diente als Ladekontrolle.
Ergebnisse
68
Zusätzlich zu der Analyse der membranständigen Fragmente wurde auch die
Entstehung von löslichem FasL in den Zellkulturüberständen mittels ELISA
analysiert. Hier wurde bei den Kontrollzellen der erwartete Anstieg von sFasL über
drei Stunden beobachtet. Die Inkubation der Zellen mit anti-CD3/anti-CD28
resultierte ebenfalls in einer Freisetzung von löslichem FasL, wenn auch mit einer
leicht verspäteten Kinetik und einer etwas verringerten Amplitude (Abbildung 5.15).
Abb. 5.15: Stimulation des TZR von PHA-Blasten führt zu verstärkter Produktion von löslichem FasL in Zellkulturüberständen. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten mit TPA/Ionomycin bzw. monoklonalen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert und die Zellkulturüberstände anschließend mittels ELISA analysiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei Versuchen mit den Mittelwerten aus Duplikaten.
Um den Einfluss der CD3/CD28-induzierten Aktivierung auf die
Oberflächenexpression vom ADAM10 zu untersuchen, wurden PHA-Blasten (Tag 8)
mit TPA/Ionomycin bzw. Antikörpern gegen CD3 und CD28 über 180 Minuten
stimuliert und anschließend mit Hilfe eines direkt-markierten ADAM10-Antikörpers
gefärbt. Die anschließende durchflusszytometrische Analyse zeigte bei mit
TPA/Ionomycin-stimulierten Kontrollzellen die erwartete Konstanz an ADAM10 auf
der Zelloberfläche mit leichtem Absenken nach 60 Minuten. Die Kinetik der
CD3/CD28-induzierten Oberflächenexpression zeigte einen sehr ähnlichen Verlauf,
mit einer leichten Reduktion im Laufe der Inkubationszeit (Abbildung 5.16).
0
0,1
0,2
0,3
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0,6
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0 3 10 30 60 90 120 150 180
OD
(45
0 n
m/5
40
nm
)
[min]
TPA/Ionomycin
CD3/CD28
sFasL
Ergebnisse
69
Abb. 5.16: Die Oberflächenexpression von ADAM10 bleibt während der Stimulation mit Antikörpern gegen CD3/CD28 nahezu konstant. PHA-Blasten wurden mit TPA/Ionomycin und immobilisierten monoklonalen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit einem direkt-konjugierten Antikörper gegen ADAM10 (Klon SHM14) durchflusszytometrisch analysiert.
Da für ADAM17 gezeigt wurde, dass die kurzfristige Stimulation mit TPA/Ionomycin
nach 10 Minuten zu einem rapiden Anstieg auf der Zelloberfläche resultiert, wurde
die Oberflächenexpression von ADAM17 auf CD3/CD28-aktivierten PHA-Blasten
ebenfalls analysiert (Abbildung 5.17). Wie erwartet, stieg der Anteil an
membranständigem ADAM17 auf der Oberfläche nach 10-minütiger Stimulation mit
TPA/Ionomycin auf ein Maximum an, um in den nachfolgenden zwei Stunden stetig
zu sinken. Wurden die PHA-Blasten mit immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und
CD28 stimuliert, wurde jedoch kein entsprechender Anstieg der ADAM17-Expression
beobachtet. Nach 120 bis 180 Minuten sank die Menge an ADAM17 auf der
Oberfläche ähnlich der TPA/Ionomycin-Kinetik ab. Nach drei Stunden wiesen TZR-
stimulierte Zellen gleiche Expressionslevel auf der Oberfläche auf, wie Zellen die mit
TPA/Ionomycin stimuliert wurden (Abbildung 5.17).
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TPA/Ionomycin
CD3/CD28
mADAM10
Ergebnisse
70
Abb. 5.17: Kinetik der Oberflächenexpression von ADAM17 während TZR-Stimulation. PHA-Blasten wurden mit TPA/Ionomycin bzw. immobilisierten monoklonalen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit einem direkt-konjugierten Antikörper gegen ADAM17 (Klon 111633) durchflusszytometrisch analysiert.
Die Aktivierung des TZR nach CD3/CD28-Stimulation führt zu intrazellulären
Signalkaskaden, die durch Mitglieder der Src-Tyrosinkinasen, insbesondere Lck und
Fyn, ausgelöst werden. Der Inhibitor PP1 reduziert die Aktivität von Src-Kinasen und
wurde eingesetzt, um den Einfluss der Src-Kinasen auf das TZR-vermittelte
Shedding des FasL zu untersuchen. Hierfür wurden PHA-Blasten (Tag 16)
unbehandelt belassen oder für eine Stunde mit 10 µM PP1 inkubiert und
anschließend mit plattengebundenen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert. Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert und mittels Western Blot
bzw. die Zellkulturüberstände über ELISA analysiert. Durch Verwendung eines
polyklonalen Antikörpers gegen den intrazellulären Teil des FasL (N20) konnte in
unbehandelten Zellen im Western Blot die zuvor beobachtete Akkumulation von
NTFs nach 90-180 Minuten detektiert werden (Abbildung 5.18, linke Hälfte). Bei
Zellen, die vor der Stimulation mit PP1 behandelt wurden, war über die gesamte Zeit
der Aktivierung keine Bildung von NTFs zu sehen (Abbildung 5.18, rechte Hälfte).
Auch die Analyse der Bildung des löslichen FasL wies auf eine Hemmung der
Proteolyse durch PP1 hin (Abbildung 5.19). In unbehandelten Zellen konnten nach
90 Minuten ansteigende Mengen sFasL gemessen werden. Nach 150-180 Minuten
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TPA/Ionomycin
CD3/CD28
mADAM17
Ergebnisse
71
stieg die Konzentration löslichen FasL im Überstand weiter an. In Überständen PP1-
behandelter Zellen war die sFasL-Konzentration über die gesamte Dauer der
Stimulation konstant und es konnte keine proteolytische Aktivierung beobachtet
werden (Abbildung 5.19).
Abb. 5.18: Die Inhibition von Src-Kinasen verhindert die CD3/CD28-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten (Tag 16) wurden unbehandelt oder mit 10 µM PP1 inkubiert und anschließend mit plattengebundenen CD3/CD28-Antikörpern stimuliert. Nach den angegebenen Zeitintervallen wurden die Zellen lysiert und die Lysate elektrophoretisch aufgetrennt. Die Detektion des FasL erfolgte mit einem polyklonalen Antikörper gegen den intrazellulären Teil (N20). GAPDH diente als Ladekontrolle.
Abb. 5.19: Die Inhibition von Src-Kinasen verhindert die CD3/CD28-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten (Tag 16) wurden unbehandelt oder mit 10 µM PP1 inkubiert und anschließend mit plattengebundenen CD3/CD28-Antikörpern stimuliert. Die Zellkulturüberstände wurden zu den angegebenen Zeitpunkten wurden mittels ELISA analysiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment mit den Mittelwerten aus Duplikaten.
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0,8
1
0 10 30 60 90 120 150 180
OD
(45
0 n
m/5
40
nm
)
CD3/CD28 [min]
sFasL
unbehandelt
PP1-behandelt
Ergebnisse
72
Die Aktivierung von T-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28
resultierte in einem ähnlichen Anstieg der FasL-Proteolyse wie die Inkubation der
Zellen mit TPA und Ionomycin. Um zu analysieren, ob auch bei der TZR-vermittelten
Induktion des Sheddings ADAM10 die hauptverantwortliche Protease darstellt,
wurden PHA-Blasten transient mit siRNAs gegen ADAM10 und/oder ADAM17
transfiziert. Als Kontrollen dienten untransfizierte Zellen bzw. PHA-Blasten, die mit
Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert wurden. 72 Stunden nach der
Transfektion wurden die Zellen mit immobilisierten Antikörpern gegen CD3/CD28
aktiviert. Nach 0, 60, 120 und 180 Minuten wurden die Zellen lysiert und
elektrophoretisch aufgetrennt. Die Bildung von NTFs wurde im Western Blot durch
Inkubation mit einem polyklonalen Antikörper gegen den intrazellulären Teil von FasL
(N20) überprüft (Abbildung 5.20).
Abb. 5.20: Die Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 reduziert die TZR-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden transient mit siRNA gegen ADAM10 und/oder ADAM17 bzw. mit Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Hilfe von CD3/CD28-Antikörpern aktiviert, lysiert und über SDS-PAGE aufgetrennt. Die Detektion des FasL erfolgte mit einem polyklonalen Antikörper (N20). Die gleichmäßige Beladung wurde über den Nachweis von GAPDH überprüft.
Die Induktion der FasL-Proteolyse über CD3/CD28 führte in den untransfizierten und
Kontroll-transfizierten Zellen (scrRNA ADAM10) zu einer Anreicherung von NTFs in
den Lysaten innerhalb der dreistündigen Stimulation (Abbildung 5.20). Bei den
scrRNA-transfizierten Zellen wurden tendenziell mehr NTFs detektiert. Die
Ergebnisse
73
Transfektion von siRNAs gegen ADAM10 reduzierte die Bildung der NTFs verglichen
mit den beiden Kontrollen und resultierte in einer Akkumulation der unprozessierten
Form des FasL (37 kDa). Die Transfektion von spezifisch gegen ADAM17 gerichteten
siRNAs resultierte in einer stärkeren Minderung der FasL-Proteolyse und nach
180 Minuten war nur eine schwache Bande auf Höhe der NTFs detektierbar. Wurden
ADAM10- und ADAM17-spezifische siRNAs in Kombination transfiziert, wurde ein
additiver Effekt sichtbar und die Bildung von FasL-NTFs war deutlich verringert.
Sowohl bei ADAM17-siRNA als auch doppelt-transfizierten Zellen wurde keine
Akkumulation von der unprozessierten Form des FasL bei 37 kDa beobachtet
(Abbildung 5.20).
Die erfolgreiche Herunterregulation von ADAM10 und/oder ADAM17 wurde durch
Western Blot-Analysen der Lysate gezeigt (Abbildung 5.21). Während sowohl die
unreife als auch mature Form von ADAM10 in Lysaten ADAM10-siRNA-transfizierter
Zellen nahezu komplett herunterreguliert war, zeigte sich in Lysaten ADAM17-siRNA-
transfizierter Zellen hauptsächlich die Reduktion von unreifem ADAM17, während die
reife Form noch deutlich nachweisbar war (Abbildung 5.21).
Abb. 5.21: Effiziente Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 in siRNA-transfizierten PHA-Blasten. 72 h nach der Transfektion von siRNAs gegen ADAM10 bzw. ADAM17 und Kontroll-RNA (scrRNA) wurden die Zellen lysiert und elektrophoretisch aufgetrennt. Monoklonale Antikörper gegen ADAM10 (11G2), ADAM17 (A318) und ein polyklonales Antiserum gegen GAPDH (6C5) wurden zur Detektion eingesetzt.
Die Zellkulturüberstände wurden parallel mittels ELISA auf das Vorhandensein von
löslichem FasL überprüft (Abbildung 5.22). Wie erwartet wurde eine Induktion der
Proteolyse bei den Kontrollzellen nach 120-180 min beobachtet und der Gehalt
Ergebnisse
74
löslichen FasL in den Überständen stieg an. Zellen, in denen ADAM10
herunterreguliert war, generierten weniger sFasL. Die Reduktion der sFasL-
Produktion war erstaunlicherweise bei Behandlung mit ADAM17-siRNA verstärkt.
Nach Transfektion mit siRNAs gegen ADAM10 und ADAM17 war in den Überständen
die geringste Menge sFasL enthalten. Im Gegensatz zur Analyse der Zelllysate
(Abbildung 5.20) konnte in diesem Experiment für untransfizierte Zellen die höchste
Proteolyse des FasL gezeigt werden (Abbildung 5.22).
Abb. 5.22: Die Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 bewirkt eine Reduktion der FasL-Proteolyse. PHA-Blasten wurden nicht oder transient mit siRNA gegen ADAM10 und/oder ADAM17 bzw. mit Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Hilfe von CD3/CD28-Antikörpern aktiviert. Löslicher FasL (sFasL) wurde in Zellkulturüberständen mittels ELISA detektiert. Gezeigt ist repräsentativ ein Experiment von drei Versuchen mit den Mittelwerten aus Duplikaten.
Zusammenfassung
Die Analyse der Expression und Aktivität von ADAM10 zeigte deutlich, dass eine
Stimulation von PHA-Blasten mit Phorbolester (TPA) und Kalziumionophor
(Ionomycin) nur wenig Einfluss auf die Oberflächenexpression nimmt. Lediglich ein
geringes Absinken wurde innerhalb der dreistündigen Stimulation gezeigt. Die
Aktivität von ADAM10 steigt durch die Stimulation jedoch und die verstärkte
proteolytische Prozessierung des FasL konnte über Bildung von sFasL und FasL-
NTFs nachgewiesen werden. Für die beobachtete Kinetik und den Anstieg der FasL-
Proteolyse müssen TPA und Ionomycin in Kombination eingesetzt werden, da die
einzelne Verwendung der beiden Stimuli nur geringe Änderungen bewirken. Für die
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 60 120 180
OD
(45
0 n
m/5
40
nm
)
CD3/CD28 [min]
untransfiziert
scrRNA
siRNA ADAM10
siRNA ADAM17
siRNA ADAM10+17
sFasL
Ergebnisse
75
Kinetik der ADAM17-Oberflächenexpression wurde ein rapider Anstieg nach
zehnminütiger Stimulation beobachtet, welche durch siRNA-Transfektion inhibiert
werden konnte. Durch Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 wurde zudem
verifiziert, dass ADAM10 im TPA/Ionomycin-induzierten Shedding die
hauptverantwortliche Protease des FasL darstellt. Durch Aktivierung des
TZR/CD3/CD28-Komplexes konnte weiterhin ein zusätzlicher Stimulus der
induzierten FasL-Proteolyse identifiziert werden. Diese Induktion kann durch
Hemmung von Src-Tyrosinkinasen blockiert werden. Im Falle des TZR-induzierten
FasL-Sheddings wurde durch siRNA-Transfektion nachgewiesen, dass sowohl
ADAM10 als auch ADAM17 eine Rolle als verantwortliche Protease bei der Spaltung
des FasL einnehmen.
5.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen
5.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen
Der genaue Mechanismus der proteolytischen Prozessierung des FasL ist bisher
ungeklärt. Es ist bekannt, dass der FasL intrazellulär in Speichervesikeln, den
sogenannten sekretorischen Lysosomen, lokalisiert ist. Im Fall einer Aktivierung wird
der FasL aktinabhängig auf die Zelloberfläche transportiert und trägt in der
immunologischen Synapse zur Eliminierung der Zielzelle bei (Lettau et al., 2006).
Eine wichtige Frage ist, wann und wo sich Enzym (ADAM10/ADAM17) und Substrat
(FasL) treffen. Um eine mögliche intrazelluläre Kolokalisation von ADAM10 in
sekretorischen Lysosomen zu analysieren, wurden Organellen von PHA-Blasten
(Tag 17) durch differentielle Zentrifugation angereichert und nachfolgend eine
Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Nach der Zentrifugation konnten sechs
Fraktionen abgenommen werden, von denen jeweils 4 µg Protein mittels Western
Blot analysiert wurden. Die Fraktionen wurden einerseits auf die auf die Präsenz von
ADAM10 und ADAM17 überprüft, andererseits wurden einige Kompartiment-
spezifische Markerproteine angefärbt (Abbildung 5.23). Als Marker für sekretorische
Lysosomen diente der FasL (Lettau et al., 2007; Schmidt et al., 2009). Als weitere
Marker für Lysosomen wurden LAMP-1 sowie die zytotoxischen Proteine Granulysin
und Granzym B detektiert. Als Markerprotein des endoplasmatischen Retikulums
wurde BiP/Grp78 gefärbt. Peroxisomen wurde über Katalase und Mitochondrien über
CoxIV nachgewiesen (Abbildung 5.23).
Ergebnisse
76
Abb. 5.23: Nachweis von ADAM10 und ADAM17 in angereicherten sekretorischen Lysosomen. PHA-Blasten (Tag 17) wurden verwendet, um Organellen durch differentielle Zentrifugation anzureichern und durch eine anschließende Dichtegradientenzentrifugation zu fraktionieren. 4 µg der jeweiligen Fraktion bzw. des Gesamtlysates (GL) bzw. der angereicherten Organellen (AO) wurden mittels Western Blot analysiert.
Die differentielle Zentrifugation mit anschließendem Dichtegradienten resultierte in
der Separation sekretorischer Lysosomen in den oberen Fraktionen. Der FasL war in
der 2 nachweisbar, in denen auch ADAM10 und ADAM17 angereichert waren.
Weitere Markerproteine (LAMP-1, Granulysin) waren ebenfalls in Fraktion 2
vorhanden, wobei im Falle von Granulysin hier nur die unreife Form von 15 kDa
detektiert wurde. Die reife Form (9 kDa) war am stärksten in Fraktion 3,4 und 6 zu
sehen. Das zytotoxische Protein Granzym B wurde am stärksten in Fraktion 6
nachgewiesen und zu geringem Anteil in den Fraktionen 3 und 4. Die Anreicherung
sekretorischer Granula in Fraktion 1 und 2 wurde durch den Nachweis von
BiP/Grp78, CoxIV und Katalase überprüft. Das ER-Protein BiP/Grp78 war
hauptsächlich in Fraktion 3 lokalisiert, der Mitochondrien-Marker CoxIV zeigte die
stärkste Bande wie erwartet in Fraktion 5 (Schmidt et al., 2009) und geringer
ausgeprägte Banden in Fraktionen 4 und 6. Färben der Nitrozellulosemembran mit
Ergebnisse
77
einem Antikörper gegen den Peroxisomen-Marker Katalase führte zu leichten
Banden in allen Fraktionen, die stärkste Akkumulation war jedoch in Fraktion 4 zu
beobachten (Abbildung 5.23).
Um eventuelle Änderungen der Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und des FasL in
sekretorischen Lysosomen nach TZR-Aktivierung zu untersuchen, wurden PHA-
Blasten vor der Lysosomenisolierung für 3 Minuten bei 37 °C mit anti-CD3 (OKT3)
und einem quervernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert. Nach der
Auftrennung in einzelne Fraktionen über einen Dichtegradienten wurden je 4 µg
Protein elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen transferiert.
Anschließend erfolgte die Detektion von ADAM10, ADAM17 und der Markerproteine
für einzelne Fraktionen (hier FasL für sekretorische Lysosomen; Granzym B für
Lysosomen; CoxIV für Mitochondrien). Auch in diesen Gradienten wurde die
Lokalisation von ADAM10 in den Fraktionen 1-3 gezeigt. ADAM17 wurde
hauptsächlich in Fraktion 1 detektiert und auch der FasL zeigte hier die stärkste
Lokalisation (Abbildung 5.24A/B).
Abb. 5.24: Lokalisation von ADAM10 und ADAM17 in sekretorischen Lysosomen nach T-Zellrezeptorstimulation. PHA-Blasten (Tag 16) wurden mit anti-CD3 und dem kreuzvernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert (B). Anschließend wurden Organellen durch differentielle Zentrifugation angereichert und durch Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert. Als Kontrolle wurden unstimulierte Zellen untersucht (A). 4 µg der jeweiligen Fraktion bzw. der angereicherten Organellen
(AO) bzw. des Gesamtlysates (GL) wurden mittels Western Blot analysiert.
Ergebnisse
78
Wurde der TZR der PHA-Blasten zuvor stimuliert, wurden bei der Detektion von
ADAM10 zusätzliche Banden bei etwa 150 kDa. Die Verteilung der reifen Form von
ADAM10 in den Fraktionen 1-3 änderte sich unter Stimulationsbedingungen nicht.
Reifes ADAM17 (80 kDa) wurde wie auch in den unstimulierten Zellen hauptsächlich
in der 1. Fraktion nachgewiesen, bei Stimulation der Zellen trat jedoch eine
zusätzliche Bande bei etwa 50 kDa in den Fraktionen 1-3 auf. Der FasL und die
anderen Markerproteine änderten ihre Lokalisation nicht (Abbildung 5.24B).
Zusammenfassung
Durch Verwendung eines OptiPrepTM-basierten Extraktionskit zur Anreicherung
sekretorischer Granula konnte gezeigt werden, dass ADAM10 und ADAM17 mit
Vesikeln der Fraktionen 1 und 2 assoziiert waren, die auch den FasL enthielten.
Durch den Nachweis verschiedener Markerproteine konnten weitere Fraktionen
spezifischen Organellen zugeordnet werden (CoxIV: Mitochondrien/Fraktion 5;
Granzym B, reifes Granulysin: dichte Granula/Fraktion 6). Basierend auf diesen
Ergebnissen könnte ein lysosomales Kompartiment bei einer intrazellulären
Prozessierung des FasL durch ADAM10/17 in Betracht gezogen werden.
5.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation
Da sowohl der FasL, als auch ADAM-Proteasen membranständig auf der Oberfläche
exprimiert werden, wird in den meisten Modellen als möglicher Ort der Proteolyse die
Zelloberfläche favorisiert. Während der Stimulation von T-Zellen mit TPA/Ionomycin
bzw. CD3/CD28-Antikörpern bleibt die Menge an membranständigem ADAM10
nahezu unverändert, die Aktivität jedoch steigt. Dies legte in Analogie zu Berichten in
der Literatur die Vermutung nahe, dass es aktivierungsinduzierte Änderungen der
Lokalisation von ADAM10 auf der Zelloberfläche geben könnte. Für den FasL wurde
bereits eine Lokalisation in Lipidmikrodomänen gezeigt, insbesondere im
Zusammenhang mit der Fas-Interaktion und Auslösung der Apoptose (Guardiola-
Serrano et al., 2010). Auch für Mitglieder der ADAM-Familie wurde berichtet, dass
eine differentielle Lokalisation von Substrat und Proteasen in verschiedenen
Bereichen der Plasmamembran die Proteolyserate beeinflusst. Für die Prozessierung
des FasL durch ADAM10 war bisher nicht bekannt, in welchen Bereichen der
Ergebnisse
79
Membran und unter welchen Umständen Enzym und Substrat aufeinandertreffen.
Mittels Dichtegradientenzentrifugation sollte deshalb untersucht werden, ob ADAM10
in T-Zellen eine Lokalisation in sogenannten Detergenz-resistenten Membranen
(DRMs, auch Lipid Rafts genannt) nachzuweisen ist und ob es
aktivierungsabhängige Änderungen der Lokalisation gibt. Nach einer Reihe von
widersprüchlichen Ergebnissen unter Verwendung kommerziell verfügbarer DRM-
Isolierungskits wurde die Isolation nach der im Material- und Methodenteil
beschriebenen klassischen Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. PHA-
Blasten (Tag 14) wurden hierfür unstimuliert oder nach vorheriger dreiminütiger
Stimulation mit dem monoklonalen anti-CD3-Antikörper (OKT3) und einem
quervernetzenden Zweitantikörper (rabbit-anti-mouse; RaM) in Lysepuffer mit Triton
X-100 lysiert. Nach Auftrennung über einen Sukrose-Dichtegradienten wurden
14 Fraktionen abgenommen und je 20 µl elektrophoretisch aufgetrennt. Nach
Transfer auf Nitrozellulosemembranen wurden ADAM10, ADAM17, FasL sowie
verschiedene Marker für leichte und schwere Membranfraktionen (DRM-Marker: Lck,
LAT (Linker for Activation of T cells); Nicht-DRM-Marker: GAPDH) detektiert.
Während in unstimulierten PHA-Blasten ADAM10 und ADAM17 nur in den unteren
Fraktionen größerer Dichte detektiert werden konnten (Abbildung 5.25A), zeigte sich
nach Stimulation des TZR eine Verschiebung zu den Fraktionen 7 und 8, die eine
geringere Dichte aufweisen (Abbildung 5.25B). Dies war sowohl für die reifen als
auch die unreifen Formen der Proteasen zu beobachten. Auch für den FasL konnte
gezeigt werden, dass nach TZR-Aktivierung mehr FasL in den leichten Fraktionen 6-
8 auftrat, während in unstimulierten Zellen hier nur relativ wenig FasL detektiert
werden konnte. Als Marker für DRMs diente die Tyrosinkinase Lck, die
bekannterweise mit leichten Fraktionen assoziiert ist, ebenso wie der DRM-Marker
LAT. GAPDH wird dagegen häufig als Markerprotein für schwere Fraktionen
verwendet. Beide DRM-Marker waren sowohl in unstimulierten als auch CD3-
stimulierten Proben in den leichten Fraktionen nachzuweisen (Abbildung 5.25A/B).
Die Aktivierung des TZR änderte die Verteilung innerhalb des Gradienten nicht. Der
Nicht-DRM-Marker GAPDH war in unstimulierten Zellen wie erwartet nur in den
schweren Fraktionen lokalisiert. Nach Stimulation mit anti-CD3 wurde jedoch auch für
GAPDH ein Auftreten in leichten Fraktionen beobachtet. Diese Verschiebung wurde
jedoch in nur wenigen Experimenten mit PHA-Blasten beobachtet.
Ergebnisse
80
Abb. 5.25: CD3-induzierte TZR-Stimulation führt zu einer aktivierungsinduzierten Verschiebung von ADAM10 und ADAM17 zu Detergenz-resistenten Membranen (DRMs). PHA-Blasten (Tag 14) wurden unstimuliert (A) oder nach Stimulation mit anti-CD3 und einem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (B) lysiert und über einen Sukrose-Dichtegradienten elektrophoretisch aufgetrennt. Über geeignete Antikörper wurden ADAM10 (11G2), ADAM17 (A318), FasL (N20), Lck (4/215), LAT (9166) und GAPDH (6C5) detektiert.
Auch in stabil mit dem FasL transfizierten Jurkat-Zellen (JFL) konnte eine
aktivierungsinduzierte Änderung der ADAM10-Lokalisation nachgewiesen werden. In
unstimulierten Zellen wurde ADAM10 hauptsächlich in Fraktionen mit großer Dichte
am Boden des Gradienten und nur in geringem Maß in den leichten Fraktionen 6-8
detektiert (Abbildung 5.26A). Durch Stimulation des TZR konnte eine verstärkte
Lokalisation von ADAM10 in Fraktionen geringerer Dichte beobachtet werden
(Abbildung 5.26B). In beiden Gradienten wurde lediglich die reife, aktive Form von
ADAM10 detektiert. Da in den verwendeten JFL-Zellen der FasL stabil überexprimiert
wird, ist er permanent der Proteolyse durch ADAM-Proteasen ausgesetzt und man
findet sowohl NTFs in Zelllysaten als auch löslichen FasL in den
Zellkulturüberständen (nicht gezeigt). Aus diesem Grund wurden in den Gradienten
größere Mengen FasL-NTFs und auch das unprozessierte Protein in den leichten
Fraktionen 6-8 nachgewiesen (Abbildung 5.26A). Nach Stimulation der Zellen wurde
eine starke Zunahme beider Formen des FasL in den leichten Fraktionen beobachtet.
Interessanterweise wurde zusätzlich zu dem verstärkten Vorkommen in Fraktion 6-8
auch ein Auftreten der NTFs in den Fraktionen 2 und 3 detektiert (Abbildung 5.26B).
Der DRM-Marker Lck zeigte sich sowohl in unstimulierten als auch stimulierten Zellen
Ergebnisse
81
in den Fraktionen 6-8 und der Nicht-DRM-Marker GAPDH wurde in beiden Ansätzen
nur in den hinteren Fraktionen 13 und 14 nachgewiesen.
Abb. 5.26: Aktivierungsinduzierte Lokalisation von ADAM10 und FasL zu Detergenz-resistenten Membranen (DRMs). Stabil mit FasL transfizierte Jurkat-Zellen (JFL) wurden mit anti-CD3 (OKT3) und einem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert (B). Kontrollzellen wurden in Zellkulturmedium inkubiert (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen mittels Western Blot analysiert. Über geeignete Antikörper wurden ADAM10 (11G2), FasL (N20), Lck (4/215) und GAPDH (6C5) detektiert.
Da zuvor gezeigt wurde, dass der Src-Inhibitor PP1 die induzierte Proteolyse des
FasL verhindern kann und dass Src-verwandte Tyrosinkinasen vermehrt an der
inneren Plasmamembran assoziieren, sollte im Folgenden analysiert werden, ob die
aktivierungsinduzierte Änderung der Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und des
FasL ebenfalls durch PP1 blockiert wird. JFL-Zellen wurden dazu entweder
unbehandelt oder mit 10 µM PP1 eine Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend
wie zuvor beschrieben stimuliert. Nach der Lyse und Fraktionierung über
Dichtegradienten wurden die erhaltenen Fraktionen mittels Western Blot analysiert.
Die CD3-bedingte Änderung der Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und des FasL
wurde in diesem Versuch verifiziert, da erneut eine Verschiebung von den schweren
(11-14) zu leichteren Fraktionen (6-9) zu beobachten war (Abbildung 5.27A/B). Dies
war besonders deutlich im Fall der reifen Form von ADAM10 zu sehen, jedoch wurde
auch die unreife Form in den Fraktionen 7 und 8 detektiert. ADAM17 wurde in
diesem Experiment auch in unstimulierten Zellen in DRM-Fraktionen detektiert, nach
Aktivierung des TZR jedoch deutlich vermehrt (Abbildung 5.27A/B).
Ergebnisse
82
Abb. 5.27: Die Inhibition von Src-Kinasen verhindert anti-CD3-induzierte Lokalisationsänderungen von ADAM10 und FasL. JFL-Zellen wurden in Medium (B) oder mit 10 µM PP1 vorinkubiert (C) und anschließend mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), ADAM17 (H300), FasL (N20), Lck (4/215) und GAPDH (6C5) überprüft.
Ergebnisse
83
Auch der unprozessierte FasL wurde nach Stimulation der Zellen mit OKT3 verstärkt
in Fraktionen geringerer Dichte nachgewiesen (7-9) und NTFs wurden schwach in
den Fraktionen 6 und 7 detektiert (Abbildung 5.27B).Durch die Vorbehandlung der
Zellen mit PP1 fiel die aktivierungsinduzierte Verschiebung in leichte Fraktionen
weniger stark aus und reifes ADAM10 sowie ADAM17 waren (waren bis auf leichte
Banden in den Fraktionen 6 und 7) kaum noch nachzuweisen. Unreifes ADAM10
wurde nicht detektiert (Abbildung 5.27C). Auch der unprozessierte FasL war in den
leichten Fraktionen 6 und 7 reduziert, NTFs wurden nicht mehr detektiert. Der DRM-
Marker Lck wurde in allen drei Gradienten in leichten Fraktionen nachgewiesen und
zeigte durch PP1-Behandlung keine Änderung der Verteilung. GAPDH zeigte eine
leichte Verschiebung zu leichteren Fraktionen nach Stimulation (Abbildung 5.27).
5.2.3 Einfluss der Cholesteroldepletion und Inhibierung posttranslationaler
Modifikationen auf die CD3/CD28-vermittelte Proteolyse des FasL
Nach der Aktivierung von T-Zellen konnte eine Verschiebung von ADAM10, ADAM17
und FasL von schweren Fraktionen zu leichten Lipidmikrodomänen beobachtet
werden. Diese Domänen zeichnen sich durch eine Anreicherung von Cholesterol und
Sphingolipiden aus. Voraussetzungen einer Lokalisation von Proteinen in lipidreichen
Regionen (Lipid Rafts) sind unter anderem posttranslationale Modifikationen wie z.B.
Palmitoylierung (Addition einer Palmitinsäure/Palmitat an Cysteinreste),
Myristoylierungen (Addition einer Myristinsäure/Myristat an N-terminale Glycinreste)
oder GPI-Anker (Addition eines Glycosylphosphatidylinositol-Ankers an den C-
Terminus eines Proteins). Um die aktivierungsinduzierte Translokation von ADAM10
und FasL näher zu untersuchen, wurde einerseits der Effekt der Cholesteroldepletion
durch Methyl--Cyclodextrin (MβCD) analysiert und weiterhin Inhibitoren der
Palmitoylierung und Myristoylierung verwendet. Dadurch sollten posttranslationale
Modifikationen identifiziert werden, die für die Lokalisation des FasL, ADAM10 und
ADAM17 in Lipidmikrodomänen von Bedeutung sind.
Um sicherzustellen, dass es sich bei den gezeigten leichten Fraktionen der
Dichtegradienten um lipidhaltige, Cholesterol-angereicherte Bereiche der
Zellmembran handelt, wurden Zellen vor der Stimulation mit MβCD behandelt und
anschließend stimuliert. MβCD depletiert zelluläres Cholesterol aus der Zellmembran
Ergebnisse
84
und führt hierdurch zur Auflösung der Signalplattformen. JFL-Zellen wurden in An-
oder Abwesenheit von 10 mM MβCD bei 37 °C vorinkubiert. Anschließend wurden
die Zellen stimuliert und lysiert. Als Kontrolle dienten Zellen, die weder behandelt
noch stimuliert wurden. Nach Auftrennung der Lysate über Dichtegradienten wurden
die einzelnen Fraktionen mittels Western Blot analysiert. Bereits in unstimulierten,
unbehandelten T-Zellen (hier FasL-transfizierte Jurkat-Zellen) wurde ADAM10 und
auch die verschiedenen Formen des FasL in leichten Fraktionen detektiert (Abb.
5.28A).
Abb. 5.28: Depletion von Cholesterol reduziert die induzierte DRM-Lokalisation von ADAM10
und FasL. JFL-Zellen wurden in Medium (B) oder mit 10 mM MCD inkubiert (C) und anschließend mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), FasL (N20) und Lck (4/215) überprüft.
Ergebnisse
85
Wie zuvor beschrieben (Abbildung 5.26) zeigte sich in unbehandelten Zellen, die mit
OKT3 stimuliert wurden, eine Anreicherung von ADAM10 und dem FasL (volle Länge
und NTFs) in den Fraktionen 6-8 (Abbildung 5.28B). Wurden die Zellen jedoch vor
der Stimulation mit MβCD behandelt, wurde eine geringere aktivierungsinduzierte
Änderung der Lokalisation detektiert. Die erfolgreiche MβCD-Behandlung mit
Cholesteroldepletion und Auflösung der Lipidplattformen konnte durch Detektion des
DRM-Markers Lck in MβCD-behandelten Zellen nachgewiesen werden. Hier wurde
im Vergleich zu unbehandelten Zellen weniger Lck in leichten Fraktionen und mehr in
schweren Fraktionen am Boden des Gradienten detektiert (Abbildung 5.28C).
In vorhergehenden Studien wurde gezeigt, dass die Lokalisation des FasL in Lipid
Rafts stark von seinem Palmitoylierungszustand abhängt (Guardiola-Serrano et al.,
2010). 2-Brompalmitat (2BP) inhibiert die Addition von Palmitinsäuren durch
Palmitoyltransferasen, was eventuell den Verlust der Raft-Lokalisation zur Folge hat.
Der Einfluss der fehlenden Palmitoylierung nach Zugabe von 2BP auf die CD3-
induzierten Lokalisationsänderungen von ADAM10, ADAM17 und FasL in DRMs
sollte im Folgenden analysiert werden. PHA-Blasten (Tag 14) wurden für 2 Stunden
entweder in Medium oder mit 100 µM 2BP bei 37 °C vorinkubiert. Anschließend
wurde der TZR über Verwendung des monoklonalen Antikörpers OKT3 aktiviert. Als
Kontrolle wurden unbehandelte, unstimulierte Zellen verwendet. Nach der Sukrose-
Dichtegradientenzentrifugation wurden die erhaltenen Fraktionen mittels Western
Blot analysiert (Abbildung 5.29). In Kontrollzellen wurden ADAM10 und ADAM17
wieder hauptsächlich in schweren Fraktionen detektiert, während der FasL deutlich in
leichten Fraktionen (7, 8), sowie der DRM-Marker Lck in den Fraktionen 6-8
nachweisbar war (Abbildung 5.29A). Nach Stimulation der Zellen wurde die zuvor
beschriebene Lokalisationsänderung von ADAM10, ADAM17 und dem FasL
beobachtet und die drei Proteine traten verstärkt in leichten Fraktionen auf
(Abbildung 5.29B). Die Behandlung der Zellen mit 2BP ergab nach TZR-Aktivierung
keine Veränderung der Positionierung. Die Src-Kinase Lck zeigte hingegen eine
weitaus geringere Abundanz in leichten Fraktionen (Abbildung 5.29C).
Ergebnisse
86
Abb. 5.29: Die Inhibition der Palmitoylierung reduziert die Translokation von ADAM10 zu DRMs. PHA-Blasten (Tag 14) wurden in Medium (B) oder mit 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) (C) inkubiert und anschließend mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), FasL (N20) und Lck (4/215) überprüft.
Eine weitere posttranslationale Modifikation, die die Lokalisation von
Transmembranproteinen in Lipidmikrodomänen fördern kann, ist die Addition eines
Myristats an N-terminale Glycinreste. Diese Modifikation kann durch 2-
Hydroxymyristylsäure (2HMA) blockiert werden. Um den Effekt fehlender
Myristoylierungen auf die CD3-induzierte Lokalisation von ADAM10 und dem FasL in
DRMs zu untersuchen, wurden CD4+-T-Zellen (Klon 12632) entweder in
Ergebnisse
87
Zellkulturmedium oder in Medium mit 100 µM 2HMA über zwei Stunden bei 37 °C
inkubiert, bevor sie mit OKT3 stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten unbehandelte,
unstimulierte Zellen. Nach Auftrennung in einzelne Fraktionen über Dichtegradienten
wurden ADAM10, FasL, Lck und GAPDH mit Hilfe geeigneter Antikörper detektiert
(Abbildung 5.30).
Abb. 5.30: Effekt der Inhibition von Myristoylierungen auf die CD3-induzierte Translokation von ADAM10 und dem FasL zu DRMs. CD4
+-T-Zellen (Klon 12632) wurden in Medium (B) oder mit
100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) (C) für 2 h bei 37 °C inkubiert, bevor sie mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), FasL (N20), Lck (4/215) und GAPDH (6C5) überprüft.
Ergebnisse
88
In unbehandelten, unstimulierten Zellen wurde unreifes ADAM10 ausschließlich und
reifes ADAM10 hauptsächlich in Fraktionen hoher Dichte am Boden des Gradienten
detektiert. Lediglich eine schwache Bande wies auf die mögliche Lokalisation von
reifem ADAM10 in leichten Fraktionen hin. Der FasL und der DRM-Marker Lck
hingegen wurden deutlich in Fraktionen geringerer Dichte nachgewiesen. Der Nicht-
DRM-Marker GAPDH wurde nur in schweren Fraktionen detektiert
(Abbildung 5.30A). Wie zuvor für PHA-Blasten und Jurkat-Zellen gezeigt, wurde auch
bei dem CD4+-T-Zellklon nach Stimulation mit anti-CD3 eine Verschiebung von
ADAM10 von schweren zu leichten Fraktionen beobachtet und auch der FasL zeigte
eine verstärkte Lokalisation in oberen Schichten des Gradientes. Interessanterweise
wurde in stimulierten Zellen bei der Detektion von ADAM10 eine Doppelbande bei
etwa 180 kDa sichtbar. Die Verteilung von Lck und GAPDH änderte sich durch die
Aktivierung des TZR nicht wesentlich (Abbildung 5.30A/B). Wurden die CD4+-T-
Zellen vor der Stimulation mit 2HMA behandelt, wurde die aktivierungsinduzierte
Translokation von ADAM10 und FasL dennoch beobachtet, sie schien sogar leicht
verstärkt zu sein (Abbildung 5.30C). Auch Lck wies ein verstärktes Vorkommen in
Fraktionen geringer Dichte auf. Die Verteilung von GAPDH änderte sich auch unter
diesen Bedingungen nicht (Abbildung 5.30C).
Die verschiedenen Inhibitoren zeigten auf die CD3-induzierte Translokation von
ADAM10 und dem FasL unterschiedliche Auswirkungen. MβCD und 2BP reduzierten
die Lokalisation in leichten Fraktionen in stimulierten Zellen, während 2HMA keinen
oder sogar verstärkenden Einfluss nahm. In der Folge sollte daher geklärt werden, ob
der Einsatz derselben Inhibitoren zu einer veränderten Proteolyserate führt. CD4+-T-
Zellen (Klon 12632) wurden 30 Minuten mit 5 mM MβCD bzw. 2 Stunden mit 100 µM
2BP oder 100 µM 2HMA oder je 100 µM 2BP und 2HMA in Kombination inkubiert.
Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, die in Kulturmedium bzw. DMSO verdünnt in
Medium über dieselbe Zeit inkubiert wurden. Anschließend wurden je 2,5x106 Zellen
auf plattengebundene anti-CD3/CD28-Antikörper gegeben und über die angegeben
Zeitintervalle stimuliert. Die Zellen wurden lysiert und elektrophoretisch aufgetrennt.
Nach dem Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde der FasL mit Hilfe eines
polyklonalen Antikörpers (N20) detektiert (Abbildung 5.31). Die entsprechenden
Zellkulturüberstände wurden mittels ELISA analysiert (Abbildung 5.32). Von jedem
Ansatz wurde zudem die Vitalität unstimulierter Zellen und von Zellen nach
180 Minuten Stimulation mittels Propidiumiodid-(PI-)Färbung überprüft
Ergebnisse
89
(Abbildung 5.33). Die Western Blot-Analyse der Zelllysate ergab hohe Levels an
FasL-NTFs in unbehandelten, DMSO- und 2HMA-behandelten Zellen nach
120 Minuten mit einem Maximum nach 180 Minuten (Abbildung 5.31). Im Vergleich
hierzu waren bei MβCD- und 2BP-behandelten Zellen weniger FasL-NTFs
nachweisbar, wobei die Behandlung von MβCD die Proteolyse des FasL deutlicher
reduzierte und nur wenig NTFs detektiert werden konnten. Die Kombination aus 2BP
und 2HMA resultierte in der größten Hemmung der FasL-Prozessierung, da hier
nahezu keine Bildung von FasL-NTFs beobachtet werden konnte (Abbildung 5.31).
Abb. 5.31: Effekt verschiedener Inhibitoren auf die CD3-induzierte Proteolyse des FasL. CD4+-
T-Zellen (Klon 12632) wurden mit 5 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA), 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) oder je 100 µM 2HMA und 2BP behandelt, bevor sie mit immobilisiertem anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten unbehandelte bzw. DMSO-behandelte Zellen. Nach den angegebenen Zeitintervallen wurden die Zellen lysiert und mittels Western Blot analysiert. FasL wurde mit einem polyklonalen Antikörper (N20) detektiert. GAPDH (Antikörper 6C5) diente als Ladekontrolle.
Die quantitative Auswertung von löslichem FasL in den Zellkulturüberständen
bestätigte das Ergebnis. In den Kontrollen und 2HMA-behandelten Zellen wurden
große Mengen sFasL detektiert, bei MβCD-behandelten Cholesterol-depletierten
Zellen war diese Menge reduziert. Zellen, bei denen durch 2BP die Palmitoylierung
inhibiert worden war, produzierten noch geringere Mengen löslichen FasL und bei
der Kombination von 2BP mit 2HMA war die stärkste Inhibition der Proteolyse zu
vermuten (Abbildung 5.32).
Ergebnisse
90
Abb. 5.32: Cholesteroldepletion und Hemmung von Palmitoylierung reduzieren die Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden unbehandelt, mit 5 mM Methyl-beta-Cyclodextrin (MβCD), 100 µM 2-Bromopalmitat (2BP), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) oder je 100 µM 2BP und 2HMA zusammen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit immobilisierten anti-CD3/CD28-Antikörpern zu den angegebenen Zeitintervallen stimuliert. Löslicher FasL (sFasL) wurde in Zellkulturüberständen mittels ELISA detektiert. Gezeigt ist repräsentativ ein Experiment von drei Versuchen mit den Mittelwerten aus Duplikaten.
Um zu überprüfen, ob die Inhibitoren und die anschließende Aktivierung des TZR zur
Apoptose der Zellen führen und dadurch das Ergebnis verfälscht werden könnte,
sollte mittels PI-Färbung der Anteil toter Zellen bestimmt werden. Unstimulierte
Zellen bzw. Zellen, die 180 Minuten stimuliert wurden, wurden mit PI-Lösung
inkubiert und anschließend durchflusszytometrisch gemessen (Abbildung 5.33). Die
Analyse zeigte, dass bereits in unbehandelten und DMSO-behandelten Zellen ein
minimaler Anstieg der Apoptose durch die CD3/CD28-Behandlung erfolgt. Wurden
die Zellen mit 5 mM MβCD behandelt, waren bereits nach der Vorinkubation doppelt
so viele tote Zellen nachweisbar. Die Stimulation MβCD-behandelter Zellen durch
anti-CD3/anti-CD28 steigerte die Zelltodrate allerdings nicht. Die Inkubation mit dem
Myristoylierungsinhibitor 2HMA führte nur zu leicht verstärktem Zelltod in
unstimulierten Zellen. Nach dreistündiger Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28
verdoppelte sich jedoch auch dieser Wert. Einen negativen Effekt auf die Vitalität
zeigte auch die Behandlung mit dem Palmitoylierungsinhibitor 2BP, der in
unstimulierten Zellen zu einer Verdopplung der Anzahl toter Zellen führte. Nach drei
Stunden CD3/CD28-Stimulation verstärkte sich dieser Effekt jedoch nur leicht.
Interessanterweise resultierte die kombinierte Verwendung von 2BP und 2HMA nur
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 60 120 180
OD
(45
0 n
m/5
40
nm
)
CD3/CD28 [min]
unbehandelt DMSO
MβCD 2HMA
2BP 2HMA+2BP
sFasL
Ergebnisse
91
in einem geringen Anstieg der PI-positiven Zellen und auch die Stimulation mit anti-
CD3/CD28 erhöhte die Apoptose in den 2BP-/2HMA-behandelten Zellen nur leicht
(Abbildung 5.33). Insgesamt lässt sich festhalten, dass die Inhibitoren einen
moderaten Einfluss auf die Zellvitalität über den Zeitraum der Stimulation hatten.
Abb. 5.33: Einfluss von Cholesteroldepletion und Inhibitoren von Palmitoylierung und Myristoylierung auf die Viabilität von PHA-Blasten. Die Zellen wurden mit 5 mM Methyl-beta-
Cyclodextrin (M CD), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA), 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) oder der Kombination aus 2HMA und 2BP behandelt und anschließend 180 Minuten mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28 stimuliert. Unbehandelte und DMSO-behandelte Zellen wurden als Kontrollen analysiert. Der Anteil toter Zellen wurde mittels Propidiumiodid-Färbung durchflusszytometrisch ermittelt.
Die Behandlung von T-Zellen mit den verschiedenen Inhibitoren hatte außerdem
keinen Einfluss auf die Aktivierbarkeit des TZR/CD3/CD28-Komplexes, wie durch
Analyse des Phosphorylierungsstatus mittels Western Blot nachgewiesen wurde
(Abbildung 5.34). CD4+-T-Zellen, die mit den entsprechenden Inhibitoren vorinkubiert
wurden, zeigten bei kurzzeitiger Stimulation durch Verwendung des anti-CD3-
Antikörpers (OKT3) und quervernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörpers
ähnliche Bandenmuster phosphorylierter Tyrosine wie unbehandelte Zellen
(Abbildung 5.34). Wurden die Zellen zur Kontrolle mit Medium oder nur mit dem
Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert, gab es keine bzw. wenig Änderungen
bezüglich des Phosphorylierungsstatus.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ve
rlu
st
der
Mem
bra
nin
teg
ritä
t [%
]
Ergebnisse
92
Abb. 5.34: Einfluss von Cholesteroldepletion und Inhibitoren von Palmitoylierung und Myristoylierung auf die Aktivierbarkeit des TZR/CD3-Komplexes. CD4
+-T-Zellen (Klon 12632)
wurden mit 5 mM Methyl-beta-Cyclodextrin (M CD), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA), 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) oder der Kombination aus 2HMA und 2BP behandelt und anschließend über die angegeben Zeitintervalle mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Negativkontrollen wurden die Zellen mit Medium bzw. Kaninchen-anti-Maus inkubiert.
Die zuvor beobachteten Lokalisationsänderungen von ADAM10 und ADAM17 nach
T-Zellrezeptorstimulation sollten weiterhin durch Immunfluoreszenzanalysen belegt
werden. Für ADAM17 ist jedoch derzeit kein geeigneter direkt-markierter Antikörper
verfügbar, weshalb diesbezüglich bisher keine weiteren Analysen durchgeführt
Ergebnisse
93
werden konnten. Die Lokalisation von ADAM10 wurde in unstimulierten bzw. CD3-
aktivierten Jurkat-Zellen (JFL) mit einem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10
gezeigt. Zur Stimulation wurden die Zellen 3 Minuten bei 37 °C mit OKT3 und
Kaninchen-α-Maus stimuliert. Die Färbung der Zellen erfolgte mit dem PE-
konjugierten ADAM10-spezifischen Antikörper bzw. einer entsprechenden
Isotypkontrolle. Anschließend erfolgte die Analyse am konfokalen Mikroskop
(Abbildung 5.35). In unstimulierten Zellen wurde wenig ADAM10 auf der
Zelloberfläche gefunden und eine diffuse Verteilung wurde beobachtet. Nach TZR-
Stimulation schien die Expression auf der Oberfläche verstärkt und ADAM10 wurde
in einzelnen kompakteren Arealen detektiert (Abbildung 5.35).
Abb. 5.35: Oberflächenexpression von ADAM10 in TZR-stimulierten Zellen. Membranständiges ADAM10 wurde in unstimulierten und CD3-stimulierten Jurkat-Zellen mit einem spezifischen Antikörper gegen humanes ADAM10 (SHM14) detektiert. Als Kontrolle wurden Zellen mit der entsprechenden Isotypkontrolle gefärbt. Maßstab 10 µM.
Ergebnisse
94
Zusammenfassung
In unstimulierten T-Zellen wurden ADAM10 und ADAM17 vor allem in Fraktionen
großer Dichte nachgewiesen (Nicht-DRMs). Nach Stimulation des TZR/CD3-
Komplexes jedoch wurde eine aktivierungsinduzierte Änderung der Lokalisation zu
Fraktionen geringer Dichte (DRMs) gezeigt. Diese Verschiebung ist abhängig von
Src-Kinasen, da der Einsatz des Inhibitors PP1 diese Lokalisationsänderung
unterbindet. Cholesteroldepletion durch MβCD führte zusätzlich zum Verlust der
Verschiebung in Analysen stimulierter Zellen. Inhibition von Palmitoylierungen (2BP)
oder Myristoylierungen (2HMA) konnte kein Effekt auf die Lokalisation von ADAM10,
ADAM17 und des FasL beobachtet werden. MβCD- und 2BP-behandelte Zellen
wiesen eine geringere proteolytische Prozessierung des FasL nach Stimulation mit
anti-CD3/CD28 auf, während 2HMA keinen Effekt zeigte.
5.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10
5.3.1 Identifizierte präzipitierte SH3-Domänen einer Phagenbibliothek
ADAM10 enthält in seiner intrazellulären Domäne zwei Prolin-reiche Regionen (AS
708-717 und 722-728), die mögliche Interaktionen mit SH3-Domäne-Proteinen
nahelegen. In Vorarbeiten im Rahmen meiner Diplomarbeit wurde bereits ein erstes
Screening einer Phagenbibliothek zur Identifizierung interagierender SH3-Domänen
von ADAM10 durchgeführt (Diplomarbeit H. Oberdoerster, 2010). Die verwendete
Phagenbibliothek enthält alle 305 bekannten humanen SH3-Domänen, welche an
das Hüllprotein pVIII von M13-Phagen fusioniert sind und so auf der
Phagenoberfläche exprimiert werden. Durch Bindung der SH3-Domäne an das
Fusionsprotein GST-hADAM10(697-748), welches die gesamte intrazelluläre
Domäne von humanem ADAM10 enthält, werden Phagen mit interagierenden SH3-
Domäne präzipitiert und können anschließend durch Sequenzierung identifiziert
werden. Im ersten Ansatz konnten 22 SH3-Domänen als potentielle Interaktoren der
intrazellulären Region von ADAM10 identifiziert werden (Abbildung 1.4). In der
vorliegenden Arbeit sollte ein komplementäres Screening zur Verifizierung
durchgeführt werden. Magnetische Beads wurden mit GST-hADAM10(697-748) oder
GST als Kontrolle beschichtet und mit den Phagen inkubiert. Beads mit gebundenen
Phagen wurden pelletiert und nach stringentem Waschen wurden die Phagen eluiert
Ergebnisse
95
und kompetente TG1-Bakterien transduziert. Nach Isolation der DNA und
anschließender Sequenzierung konnten potentiell interagierende SH3-Domänen über
Verwendung des Swiss-Prot-Servers mit dem BLAST-Programm identifiziert werden.
In diesem Ansatz wurden insgesamt 133 Klone sequenziert und identifiziert, 37 Klone
von GST-Präzipitaten und 96 Klone von GST-hADAM10(697-748)-Präzipitaten.
Zusammen mit dem ersten Ansatz wurden 75 Sequenzierungen von Präzipitaten mit
dem GST-Kontrollprotein sowie 216 von Präzipitaten mit GST-hADAM10(697-748)
durchgeführt. Insgesamt wurden 38 SH3-Domänen identifiziert, die ausschließlich mit
GST-hADAM10(697-748), nicht aber mit dem GST-Kontrollprotein interagierten
(Abbildung 5.36; Tabelle 5.1). Einige SH3-Domänen wurden hierbei mehrmals,
andere jedoch nur ein- oder zweimal identifiziert.
Abb. 5.36: Mit dem Zielprotein GST-hADAM10(697-748) präzipitierte SH3-Domänen. Auf M13-Phagen exprimierte SH3-Domänen, die von GST-hADAM10(697-748) und nicht dem Kontrollprotein GST gebunden wurden, wurden sequenziert und identifiziert.
Am häufigsten wurde Endophilin-A2 (8 Klone), Lck (5 Klone) und ZDHHC6 (3 Klone)
identifiziert. Für das Kontrollprotein GST wurden auch eine Vielzahl von SH3-
Domänen präzipitiert (siehe Anhang Tabelle A1). In der weiteren Analyse wurden
jedoch potentielle Interaktionen mit SH3-Domänen, die mit GST allein und mit GST
und GST-hADAM10(697-748) präzipitiert worden waren, nicht weiter untersucht.
Ergebnisse
96
Tab. 5.1: GST-hADAM10(697-748)-präzipitierte SH3-Domänen: Funktionen und Lokalisation der jeweiligen potentiellen Bindungspartner (adaptiert von der UniProt-Protein-Datenbank (UniprotKB); modifiziert nach Ebsen et al., 2014).
Name des Proteins Uniprot-
Nr. Treffer Funktion des Proteins Lokalisation
Endophilin-A2 Q99961 8 Endozytose, Podosomen Zyt1, PM, Endo, Podo
Lck P06239 5 Src-Tyrosinkinase Zyt, PM, LR
ZDHHC6 Q9H6R6 3 Palmitoylierungstransferase ER
Growth factor receptor binding protein 2
P62993 2 Adapter (Ras-Signalweg) Zyt, Endo, Nuk, Golgi
HS1/HCLS1/LckBP1 P14317 2 Adapter (Lck-Signalweg) PM, Zyt, Mito
SH3 domain protein 7, HIP-55
Q9UJU6 2 Adapter, Endozytose Zyt, ZK, PM, Golgi, ER, Podo
Otoraplin Q9NRC9 2 unbekannt sekretiert
Dedicator of cytokinesis protein 4
Q8N1I0 2 Migration, GTP-Austauschfaktor
EMS, Zyt
SH3 domain protein 21 A4FU49 2 unbekannt unbekannt
RUN and SH3 domain-containing protein 1
Q9BVN2 2 Adapter, Zytoskelett Zyt, Endo, Golgi
Rho GEF 38 Q9NXL2 2 GTP-Austauschfaktor Zyt
PKC and CK substrate in neurons 3
Q9UKS6 1 Endozytose Zyt, PM
GRB2-related adaptor protein 2
O75791 1 Adapterprotein (LAT, SLP-76)
Zyt, Nuk, Endo
c-Src P12931 1 Tyrosinkinase Zyt, PM, Nuk, Mito
c-Abl P00519 1 Tyrosinkinase, Zytoskelett Zyt, Nuk, Mito
Sorting nexin 18 Q96RF0 1 Endozytose, Vesikeltransport
PM, Zyt, Endo
Adaptor protein crk (c-Crk)
P46108 1 Adapterprotein, Aktinzytoskelett
Zyt, PM
Rho GEF 19 Q8IW93 1 GTP-Austauschfaktor, Zytoskelett
Zyt
Peroxin-13 Q92968 1 peroxisomaler Import Peroxisomen
Ephexin-1 Q8N5V2 1 GTP-Austauschfaktor Zyt, PM, Wachstumskegel
Rho GAP 32, RICS protein
A7KAX9 1 GTPase-aktivierendes Protein
Zyt, ZK, PM, Golgi, ER, Endo
ARHGEF16, Ephexin-4 Q5VV41 1 GTP-Austauschfaktor Zyt
Growth arrest-specific protein 7
O60861 1 neuronale Differenzierung Zyt
unconventional myosin1E Q12965 1 Zytoskelett Zyt, ZK
Rho GEF 4 Q9NR80 1 GTP-Austauschfaktor Zyt, PM
Vinexin SH3 #2 O60504 1 Zytoskelett Zyt, ZK, Nuk
Vinexin SH3 #3 O60504 1 Zytoskelett Zyt, ZK, Nuk
Ergebnisse
97
RIMS Binding protein 3A Q9UFD9 1 unbekannt unbekannt
Rho GAP 33, Sorting nexin 26
O14559 1 Proteintransport Zyt, PM
LIM and SH3 domain protein 1
Q14847 1 Adhäsion, Zytoskelett Zyt
unconventional myosin VIIa
Q13402 1 Zytoskelett, intrazelluläre Bewegung
Zyt
Disks large homolog 1 Q12959 1 Scaffoldprotein ER; PM, ZK
Erythroid α spectrin P02549 1 Zellform, Aktinzytoskelett Zyt
non erythroid α spectrin (fodrin)
Q13813 1 Ca2+
-abhängige Bewegung Zyt
SH3 domain-containing protein 19, Eve-1
Q5HYK7 1 Zellmorphologie, Zytoskelett Zyt, Nuk
RIMS Binding protein 2 O15034 1 synaptische Transmission PM, ZK
peripheral PM protein CASK
O14936 1 Calmodulin-abhängige Serinkinase
PM, Zyt, Nuk
Dedicator of cytokinesis protein 2
Q92608 1 Migration, GTP-Austauschfaktor
EMS, PM, Zyt
1Abkürzungen: EMS, Endomembransystem; ER, Endoplasmatisches Retikulum; Endo, Endosomen;
GTP, Guanosintriphosphat; LR, Lipid Rafts; Mito, Mitochondrion; Nuk, Nukleus; PM, Plasmamembran;
Podo, Podosomen; ZK, Zellkontakt; Zyt, Zytosol.
Unter den 38 identifizierten SH3-Domänen, die mit der intrazellulären Domäne von
ADAM10 präzipitierten, gehören viele zu Proteinfamilien, die bereits für andere
ADAM-Proteasen als Interaktionspartner beschrieben wurden. In einigen Fällen
konnten regulatorische Funktionen im Rahmen der Kontrolle der ADAM-Aktivitäten
nachgewiesen werden. Einige der identifizierten SH3-Domäne-Proteine spielen bei
Endozytoseprozessen eine Rolle oder fungieren als Adapterproteine. Weiterhin
wurden Mitglieder der Src-Kinasen sowie die Palmitoylierungstransferase ZDHHC6
identifiziert. Im Folgenden wurde für ausgewählte potentielle Bindungspartner die
Interaktion mit der zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 verifiziert. Für einige der
näher untersuchten Kandidaten wurde zunächst die Expression in T-Zellen analysiert
(Abbildung 5.37). Hierbei wurden Zelllysate von PHA-Blasten, CD4+-T-Zellen (Klon
12603) und Jurkat-Zellen mittels Western Blot analysiert. Endophilin-A2, Lck und
Grb2 wurden in allen getesteten Zellen nachgewiesen und können somit theoretisch
mit ADAM10 in T-Zellen interagieren.
Ergebnisse
98
Abb. 5.37: Expression potentieller Interaktoren von ADAM10 in T-Zellen. Zelllysate von PHA-Blasten, CD4
+-T-Zellen (Klon 12603) und Jurkat-Zellen (JE6-1) wurden auf das Vorhandensein
möglicher interagierender SH3-Domäne-Proteine durch Verwendung spezifischer Antikörper untersucht (ADAM10: 11G2; EEN: 2F5; Lck: 4/215; Grb2: C-23).
5.3.2 Verifizierung potentieller Interaktionen
Bevor mittels Pull-Down-Analyse und Immunpräzipitation eine Verifizierung der
Interaktionen und Immunpräzipitationen begonnen wurde, wurden zunächst für eine
Vielzahl potentieller Bindungspartner im Labor vorhandene GST-Fusionsproteine ihre
Reinheit und Konzentration überprüft, indem je 25 µg des entsprechenden
Fusionsproteins elektrophoretisch aufgetrennt und mit Coomassie-Färbelösung
detektiert wurden (siehe Anhang Abbildungen A1-3).
Endophilin-A2
Bei der Identifizierung interagierender SH3-Domänen mit Hilfe der Phagenbibliothek
wurde die SH3-Domäne von Endophilin-A2 (EEN, SH3GL1) acht Mal als potentieller
Bindungspartner von GST-hADAM10(697-748), jedoch nicht von GST, identifiziert
(Abbildung 5.36). Endophilin-A2/EEN gehört zur Familie der endozytotisch aktiven
Proteine der Endophiline und ist im Zytoplasma lokalisiert. Um eine Interaktion von
ADAM10 mit Endophilin-A2/EEN zu überprüfen, wurde ein GST-Fusionsprotein der
SH3-Domäne kloniert und für Pull-Down-Analysen verwendet. Mit Hilfe des
Ergebnisse
99
Fusionsproteins konnte ADAM10 aus Lysaten von PHA-Blasten (Tag 16) präzipitiert
werden (Abbildung 5.38A). Als Negativkontrolle wurde GST verwendet. Während bei
der Kontrolle kein präzipitiertes ADAM10 detektiert werden konnte, wurde im Pull-
Down mit GST-EEN SH3 die unreife Form von ADAM10 bei etwa 80 kDa
nachgewiesen. Reifes ADAM10 (60 kDa) konnte nicht detektiert werden, obwohl im
Zelllysat beide Formen deutlich nachgewiesen wurden (Abbildung 5.38A).
Abb. 5.38: Die zytoplasmatische Domäne von ADAM10 interagiert in vitro mit der SH3-Domäne von Endophilin-A2/EEN. (A) PHA-Blasten (Tag 16) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit GST als Kontrollprotein bzw. dem Fusionsprotein GST-EEN SH3 verwendet. Nach Auftrennung und Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde ADAM10 detektiert (Klon 11G2). Zur Kontrolle der Spezifität der Färbung wurden 10 µg Lysat aufgetrennt. (B) Zur weiteren Verifizierung der Interaktion von ADAM10 und Endophilin-A2 wurden HEK293T-Zellen transient mit murinem HA-gekoppelten ADAM10 (mADAM10) oder mit mADAM10 in Kombination mit humanem Endophilin-A2/EEN transfiziert. 18 Stunden später wurden die Zellen lysiert und mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen HA (Klon 3F10) oder EEN (Klon 2F5) Immunpräzipitationen durchgeführt. Untransfizierte Zellen wurden als Negativkontrolle eingesetzt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden jeweils 10 µg Lysat aufgetrennt.
In einem weiteren Versuch wurden HEK293T-Zellen entweder mit murinem HA-
markiertem ADAM10 oder ADAM10 in Kombination mit humanem Endophilin-
A2/EEN transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen lysiert und (Ko-)
Immunpräzipitationen durchgeführt. Da die intrazelluläre Domäne von ADAM10 im
Menschen sich nur in einer Aminosäure von der murinen zytoplasmatischen Domäne
unterscheidet, die zudem außerhalb der Prolin-reichen Region liegt, wurde das
murine Konstrukt verwendet. Die effiziente Transfektion der Konstrukte wurde in
Lysaten gezeigt (Abbildung 5.38B). Aus den Zelllysaten wurden
Immunpräzipitationen mit einem monoklonalen Antikörper gegen HA (Klon 3F10)
bzw. einem monoklonalen Antikörper gegen Endophilin-A2/EEN (Klon 2F5)
A B
Ergebnisse
100
durchgeführt. Die Präzipitation von mADAM10 mittels anti-HA-Antikörper aus
doppelt-transfizierten Zellen führte zur Ko-Immunpräzipitation von Endophilin-
A2/EEN, nachgewiesen mit dem monoklonalen anti-Endophilin-A2-Antikörper
(Abbildung 5.38B, oberer Teil, IP: HA). Zusätzlich wurde durch Präzipitation von
Endophilin-A2/EEN mADAM10 präzipitiert und mittels -HA-Antikörper nach längerer
Expositionszeit detektiert (Abbildung 5.38B, unterer Teil, IP: EEN). Die Präzipitation
von Endophilin-A2/EEN führte auch in untransfizierten Zellen zur Anreicherung von
endogenem Endophilin-A2/EEN (Abbildung 5.38B, oberer Teil, IP: EEN) und auch in
den Lysaten wurde nach längerer Belichtung endogenes Endophilin-A2/EEN
detektiert (nicht gezeigt).
Tyrosinkinasen: Mitglieder der Src-Familie und Abl
Bei der Identifizierung von interagierenden SH3-Domänen mittels Phagenbibliothek
wurden drei Tyrosinkinasen als potentielle Bindungspartner bestimmt. Aus der
Familie der Src-Kinasen wurde Lck hierbei am häufigsten mit GST-hADAM10(697-
748)-beladenen Beads präzipitiert (5 Treffer), während Src und die Tyrosinkinase Abl
jeweils einmal identifiziert wurden (Abbildung 5.36). Src-Kinasen und auch Abl sind
bei einer Vielzahl von Signaltransduktionsprozessen beteiligt und regulieren
Zellwachstum, -migration und -adhäsion. Auch für verschiedene ADAM-Mitglieder
wurden Interaktionen mit Src-Kinasen und Abl nachgewiesen. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit wurden zur Verifizierung der potentiellen Bindungen Pull-Down-
Analysen und Ko-Immunpräzipitationen durchgeführt. Stabil-transfizierte Jurkat-
Zellen (JFL) wurden lysiert und mit Glutathion-Beads und 10 µg Fusionsprotein der
jeweiligen SH3-Domäne verschiedener Kinasen versetzt. Nach elektrophoretischer
Auftrennung und Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde ADAM10 durch
Inkubation mit einem Antikörper (Klon 11G2) detektiert. Als Kontrolle der Spezifität
dienten GST bzw. die SH2-Domänen der entsprechenden Kinase (Abbildung 5.39).
Ergebnisse
101
Abb. 5.39: SH3-Domänen von Src-verwandten Kinasen präzipitieren ADAM10. Jurkat-Zellen (JFL) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit SH2-oder SH3-Fusionsproteinen verschiedener Src-Kinasen eingesetzt. GST diente als Negativkontrolle. ADAM10 wurde mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers detektiert (Klon 11G2). Zur Kontrolle der Spezifität der Färbung wurden 10 µg Lysat aufgetrennt.
Im Lysat konnte die reife, aktive Form von ADAM10 deutlich bei 60 kDa detektiert
werden und auch die unreife Form (80 kDa) wurde als schwächere Bande
nachgewiesen. Während in der GST-Kontrolle und SH2-Domäne-Fusionsproteinen
kein reifes oder unreifes ADAM10 präzipitiert wurde, zeigte sich in Präzipitationen der
SH3-Domänen von Abl, Fyn, Src, Hck und Yes die reife Form von ADAM10
(Abbildung 5.39). Hierbei wurde für Abl die stärkste Interaktion mit ADAM10
beobachtet. In Präzipitaten mit der SH3-Domäne von Lck wurde bei kurzer
Belichtung zunächst kein ADAM10 detektiert, jedoch konnte nach längerer
Belichtungszeit auch für Lck-SH3 eine Interaktion mit ADAM10 nachgewiesen
werden (Daten nicht gezeigt).
Um die Interaktion von ADAM10 und der Src-Kinase Lck zusätzlich zu verifizieren,
wurden Immunpräzipitation mit monoklonalen Antikörpern gegen Lck (Klone 4/129
und 4/215) mit Lysaten von Jurkat-Zellen (JE6-1) durchgeführt. Durch die
Präzipitation von Lck konnte reifes und unreifes ADAM10 präzipitiert werden
(Abbildung 5.40). Als Positivkontrolle wurde eine Immunpräzipitation von ADAM10
mit dem Antikörper 11G2 durchgeführt.
Ergebnisse
102
Abb. 5.40: Lck kopräzipitiert ADAM10. Jurkat-Zellen (JE6-1) wurden lysiert und für Immunpräzipitationen mit monoklonalen Antikörpern gegen die Tyrosinkinase Lck verwendet (Klone 4/129 und 4/215; je 2 µg). Endogenes ADAM10 wurde mit dem Antikörper 11G2 detektiert. Als Positivkontrolle wurde eine Immunpräzipitation von ADAM10 (Klon 11G2, 2 µg) analysiert. Protein-G-Beads wurden als Kontrolle unspezifischer Bindungen eingesetzt.
Adapterproteine der Grb2-Familie
Adapterproteine sind für Protein-Protein-Interaktionen essentiell und an der
Formierung von Proteinkomplexen von beteiligt (Chardin et al., 1995; Leo et al.,
2002). Die Familie der Grb2- (Growth factor receptor-bound protein 2-)
Adapterproteine umfasst drei Mitglieder (Grb2, GRAP (Grb2-related adaptor protein),
GRAP2), die im Zytoplasma lokalisiert sind. Beim Screening interagierender SH3-
Domänen wurden zwei der drei Mitglieder als potentielle Interaktoren der
zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 identifiziert (Abbildung 5.36; Grb2, zwei
Treffer; GRAP2, 1 Treffer). Eine Verifizierung der Interaktionen konnte durch Pull-
Down-Analysen unter Verwendung des Fusionsproteins GST-hADAM10(697-748)
und Ko-Immunpräzipitation mit dem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10
(11G2) aus Jurkat-Zelllysaten (JE6-1) erbracht werden. Durch Inkubation der
Nitrozellulosemembran mit einem polyklonalen Antikörper gegen Grb2 (C-23) wurde
in GST-hADAM10(697-748)-Präzipitaten endogenes Grb2 detektiert, nicht jedoch in
der GST-Kontrolle. Zusätzlich führte die Immunpräzipitation von ADAM10 zur Ko-
Präzipitation von Grb2, welches in der Protein-G-Negativkontrolle nicht nachweisbar
war (Abbildung 5.41A, oben). Durch anschließendes Färben der Membran mit dem
Ergebnisse
103
polyklonalen Antiserum gegen humanes ADAM10 (Tier 1) konnte die erfolgreiche
Immunpräzipitation von ADAM10 aus dem Zelllysat gezeigt werden
(Abbildung 5.41A, unten).
Um zu untersuchen, ob auch die anderen Mitglieder der Grb2-Familie mit ADAM10
interagieren (GRAP2 wurde ebenfalls als potentielles interagierendes Protein
identifiziert), wurden weitere Pull-Down-Analysen durchgeführt. Hierbei wurde GST
bzw. die C- und N-terminalen SH3-Domänen von Grb2, GRAP und GRAP2
gekoppelt an GST verwendet, um aus Lysaten von Jurkat-Zellen (JFL) zu
präzipitieren. Die anschließende Detektion von ADAM10 mit Hilfe des Antikörpers
11G2 zeigte, dass reifes ADAM10 und (etwas schwächer) auch unreifes ADAM10 im
Wesentlichen an die C-terminalen SH3-Domänen aller Grb2-Familienmitglieder
bindet (Abbildung 5.41B). Unter Verwendung der N-terminalen Domänen dagegen
konnte eine Interaktion mit ADAM10 kaum beobachtet werden (Abbildung 5.41B).
Abb. 5.41: ADAM10 interagiert in vitro mit Adapterproteinen der Grb2-Familie. (A) Lysate von Jurkat-Zellen (JE6-1) wurden für Pull-Down-Analysen mit 10 µg des Fusionsproteins GST-ADAM10(697-748) bzw. GST als Negativkontrolle verwendet. Zusätzlich wurde mit dem monoklonalen anti-ADAM10-Antikörper 11G2 eine Immunpräzipitation durchgeführt. Protein-G diente als Kontrolle unspezifischer Bindungen. Präzipitiertes Grb2 wurde mit einem polyklonalen Antikörper (C-23) detektiert. Anschließend erfolgte die Detektion von ADAM10 mit einem polyklonalen Antiserum (Tier 1). (B) Jurkat-Zellen (JFL) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit Fusionsproteinen der N- bzw. C-terminalen SH3-Domänen von Grb2, GRAP und GRAP2 durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde GST verwendet. Die Detektion von ADAM10 erfolgte mit dem Antikörper 11G2. Als Spezifitätskontrolle wurden 15 µg Gesamtlysat analysiert.
Ergebnisse
104
Mitglieder der PACSIN-Familie
PACSIN-Proteine gehören zur Familie der PCH-(Pombe Cdc15 homology-)Proteine
und stellen Adapterproteine dar, die bei Endo- und Exozytoseprozessen eine Rolle
spielen und auch am Vesikeltransport beteiligt sind (Chitu und Stanley, 2007;
Aspenström, 2009). Die drei Mitglieder der PACSIN-(Protein kinase C and casein
kinase substrate in neurons protein-)Familie besitzen je eine SH3-Domäne und es
konnte bereits gezeigt werden, dass verschiedene ADAM-Proteasen mit PACSINen
interagieren und dass diese Interaktionen die Expression oder Aktivität beeinflussen
(Cousin et al., 2000; Mori et al., 2003). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde
initial die SH3-Domäne von PACSIN3 mit dem Fusionsprotein GST-hADAM10(697-
748) präzipitiert (Abbildung 5.36). Zur Verifizierung der Interaktion von ADAM10 mit
PACSINen wurden Pull-Down-Analysen mit GST-Fusionsproteinen der SH3-
Domänen der drei PACSINe durchgeführt. Die Verwendung eines gegen ADAM10
gerichteten Antikörpers führte zur Detektion von reifem und unreifem ADAM10
(Abbildung 5.42).
Abb. 5.42: Interaktion von ADAM10 mit SH3-Domänen der PACSINe. Jurkat-Zellen (JFL) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit jeweils 15 µg GST-Fusionsproteinen der SH3-Domänen von PACSIN1-3 durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde GST verwendet. Die Detektion von ADAM10 erfolgte mit dem Antikörper 11G2. Als Spezifitätskontrolle wurden 10 µg Gesamtlysat analysiert.
Ergebnisse
105
In einem zusätzlichen Experiment wurden HEK293T-Zellen mit myc-markiertem
PACSIN1, -2 und -3 transfiziert und nach 18 Stunden für Pull-Down-Analysen lysiert.
Als Negativkontrollen dienten untransfizierte bzw. Leervektor-transfizierte Zellen.
Durch Präzipitation mit dem GST-hADAM10(697-748)-Fusionsprotein konnten aus
Lysaten von PACSIN-Transfektanten alle drei PACSINe über Färbung mit einem
anti-myc-Antikörper detektiert werden (Abbildung 5.43). PACSIN3 zeigte hierbei die
stärkste Bande. Bei Präzipitaten aus Lysaten von Kontrollzellen konnte keine
Interaktion beobachtet werden. Der entsprechende Versuch wurde zudem mit dem
ADAM17- Fusionsprotein (GST-hADAM17(694-824)) durchgeführt und auch hier
wurde eine Interaktion der zytoplasmatischen Domäne von ADAM17 mit allen
PACSINen gezeigt. Die stärkste Interaktion konnte auch für ADAM17 mit PACSIN3
beobachtet werden (Abbildung 5.43). Bei Präzipitationen mit GST wurde hingegen
keine Bindung der PACSINe beobachtet.
Abb. 5.43: PACSINe interagieren mit ADAM10 und ADAM17. HEK293T-Zellen wurden mit myc-markiertem PACSIN1, -2 und -3 transfiziert. Als Kontrolle wurden untransfizierte bzw. Vektor-transfizierte (pcDNA3.1) Zellen verwendet. 18 Stunden später wurden die Zellen lysiert und Pull-Down-Analysen mit je 10 µg GST, GST-ADAM10(697-748) und GST-ADAM17(694-824) durchgeführt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden jeweils 5 µg Lysat aufgetrennt. Die Detektion der PACSINe erfolgte über einen monoklonalen Antikörper gegen den myc-Teil (Klon 46-0603).
Ergebnisse
106
Mitglieder der Sorting-Nexin-Familie
SNXe (Sorting nexins) regulieren den intrazellulären Transport von Proteinen, die
Signaltransduktion und auch die Endozytose. Sie werden ubiquitär exprimiert und
sind im Zytoplasma lokalisiert. Durch ihre Lipid-bindende Phox-(PX-)Domäne oder
durch Protein-Protein-Interaktionen über ihre SH3-Domänen können sie ähnlich wie
die PACSINe auch mit Membranen assoziieren. SNX9, SNX18 und SNX33 bilden die
SNX9-Subfamilie. Für andere ADAM-Mitglieder wurden bereits Interaktionen mit
SNX9 gezeigt. Beim Screening der Phagenbibliothek im Rahmen der vorliegenden
Arbeit wurde SNX18 als potentieller Interaktionspartner identifiziert (Abbildung 5.36).
Durch Überexpression der SNXe in HEK293T-Zellen konnte die Interaktion ebenfalls
verifiziert und auf die anderen Mitglieder SNX9 und SNX33 ausgeweitet werden. Zu
diesem Zweck wurden die Zellen transient mit HA-getaggten Konstrukten der SNXe
transfiziert und 18 Stunden später Pull-Down-Analysen mit den Fusionsproteinen
GST-ADAM10(697-748) und GST-ADAM17(694-824) bzw. GST als Kontrollprotein
durchgeführt (Abbildung 5.44).
Abb. 5.44: Sorting Nexins (SNXs) interagieren mit den zytoplasmatischen Domänen der Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17. HEK293T-Zellen wurden mit HA-getaggtem SNX9, SNX18 und SNX33 transfiziert. Als Kontrolle wurden untransfizierte bzw. Vektor-transfizierte (p12linker) Zellen verwendet. 18 Stunden später wurden die Zellen lysiert und Pull-Down-Analysen mit je 25 µg GST, GST-ADAM10(697-748) und GST-ADAM17(694-824) durchgeführt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden jeweils 20 µg Lysat aufgetrennt. Die Detektion der SNXe erfolgte über einen monoklonalen Antikörper gegen den HA-Teil (Klon 3F10).
Ergebnisse
107
SNX9, SNX18 und SNX33 konnten mit den intrazellulären Domänen von ADAM10
und ADAM17 präzipitiert werden, nicht jedoch mit GST. Die stärkste Interaktion
wurde für ADAM10 und SNX9 beobachtet werden, aber auch der intrazelluläre Teil
von ADAM17 konnte SNX9 effektiv präzipitieren. SNX18 wurde ebenfalls stark von
ADAM10 und ADAM17 gebunden. Die Interaktion von SNX33 mit ADAM10 und
ADAM17 fiel dagegen schwach aus, war jedoch für ADAM10 stärker ausgeprägt.
Zusammenfassung
Durch die Analyse interagierender SH3-Domänen der zytoplasmatischen Domäne
von ADAM10 mittels Phagenbibliothek konnten 38 potentielle Interaktionspartner
identifiziert werden. Eine Verifizierung der Interaktion mit ADAM10 über Pull-Down
und/oder Immunpräzipitationen erfolgte für Endophilin-A2, Src-verwandte Kinasen
(Abl, Fyn, Hck, Lck, Src, Yes), Grb2-Adapterproteine (Grb2, GRAP, GRAP2), SNXe
(SNX9, SNX18, SNX33) und PACSINe (PACSIN1-3). Auch für ADAM17 konnten
einige der genannten Interaktion nachgewiesen werden (SNXe, PACSINe).
Diskussion
108
6. Diskussion
6.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden
6.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10
Der FasL stellt ein wichtiges regulatorisches Effektormolekül auf T- und NK-Zellen
dar. Durch Bindung an seinen Rezeptor Fas wird Apoptose in Fas-positiven Zellen
induziert. Die Expression des FasL muss auf Grund dieses zytotoxischen Potentials
streng kontrolliert werden. Dies wird neben transkriptionaler Kontrolle auch durch
verschiedene posttranslationale Modifikationen erreicht: die Speicherung des FasL in
sekretorischen Lysosomen und die aktivierungsinduzierte Mobilisierung auf die
Oberfläche sowie die proteolytische Prozessierung des FasL durch Metalloproteasen
dienen der regulierten Exposition des FasL auf der Zelloberfläche. Als
verantwortliche Protease wurde in Inhibitoren-basierenden Experimenten ADAM10
identifiziert (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007). Über die ADAM10-Expression in
T-Zellen waren jedoch bislang keine Details bekannt. Die Aktivität und Expression
von ADAM-Proteasen wird häufig durch Phorbolester (TPA) und/oder
Kalziumionophor (Ionomycin) gesteigert (Sanderson et al., 2005, Nagano et al.,
2004; Horiuchi et al., 2007; Guo et al., 2012). In diesem Zusammenhang sollte im
Rahmen dieser Arbeit zunächst der Einfluss von Phorbolester und Kalziumionophor
auf die ADAM10-Oberflächenexpression analysiert werden. PHA-aktivierte T-
Zellblasten wurden mit TPA und Ionomycin stimuliert und die Oberflächenexpression
von ADAM10 durchflusszytometrisch bestimmt. ADAM10 zeigte eine konstitutiv hohe
Expression auf der Zelloberfläche in unstimulierten Zellen. Nach 10 Minuten gab es
in einigen der untersuchten T-Zellpopulationen einen geringen Anstieg an
membranständigem ADAM10 und nach einer halben Stunde wurde in der Regel ein
Absinken von ADAM10 auf den Ausgangswert gemessen. Nach einstündiger
Stimulation verringerte sich die Expression etwas und während der folgenden zwei
Stunden wurde eine kontinuierliche, aber schwache Abnahme von ADAM10 auf der
Oberfläche beobachtet (Abbildung 5.1).
Carey und Kollegen zeigten über Biotinylierung von Membranproteinen, dass auf der
Plasmamembran vorwiegend reifes ADAM10 lokalisiert ist (Carey et al., 2011). Daher
ist davon auszugehen, dass die durchflusszytometrisch gemessene
Oberflächenexpression von ADAM10 die Menge an reifem ADAM10 auf der
Diskussion
109
Oberfläche darstellt. Der Verlauf der ADAM10-Oberflächenexpression konnte auch
durch die Analyse von Gesamtlysat stimulierter Zellen beobachtet werden. Die reife,
aktive Form von ADAM10, die ein Molekulargewicht von etwa 60 kDa aufweist,
konnte mittels Western Blot-Analyse detektiert werden und auch hier wurde eine
leichte, stetige Abnahme von ADAM10 während der dreistündigen Stimulation
beobachtet (Abbildung 5.2). Diese Reduktion könnte auf proteolytischer
Prozessierung von ADAM10 durch andere Mitglieder der ADAM-Familie (ADAM9 und
15) (Tousseyn et al., 2009) oder Internalisierung von ADAM10 beruhen. Eine
Clathrin-abhängige Internalisierung mit anschließendem Recycling in frühen
Endosomen bzw. proteosomaler Abbau in späten Endosomen wurde als
regulatorischer Mechanismus für ADAM12 gezeigt. Voraussetzung war dabei das
Vorhandensein einer zytoplasmatischen Domäne mit Prolin-reichen Regionen zur
Interaktion mit SH3-Domäne-Proteinen, im Speziellen mit dem Adapterprotein Grb2
(Stautz et al., 2012).
Parallel zur Kinetik von ADAM10 auf der Zelloberfläche wurde die
Oberflächenexpression des FasL während der TPA/Ionomycin-Stimulation analysiert.
Nach 10 Minuten konnte ein Maximum detektiert werden, anschließend sank die
Expression wieder ab. Nach 90 Minuten wurde ein zweiter Anstieg der FasL-
Expression auf der Zelloberfläche gemessen (Abbildung 5.3). Durch vorhergehende
Studien innerhalb der Arbeitsgruppe kann der biphasische Verlauf auf die schnelle
Mobilisierung aus sekretorischen Lysosomen in der ersten Phase und neu
synthetisiertem FasL in der zweiten Phase zurückgeführt werden (Lettau et al.,
2004). Die Freisetzung von löslichem FasL nach TPA/Ionomycin-Stimulation wurde
mittels ELISA analysiert (Abbildung 5.4).
In einigen Veröffentlichungen wurde berichtet, dass die Aktivität von ADAM10 durch
Kalziumionophor, nicht jedoch durch Phorbolester, gesteigert wird (Sahin et al., 2004;
Sanderson et al., 2005). Der genaue Effekt der einzelnen Agentien auf die
Oberflächenexpression von ADAM10 im Zusammenhang mit der Proteolyse des
FasL wurde jedoch bisher nicht detailliert untersucht. Im Folgenden sollte analysiert
werden, ob der Einsatz von Phorbolester bzw. Kalziumionophor allein zur induzierten
Prozessierung des FasL führen kann oder ob nur die Kombination beider Stimuli zur
effektiven Proteolyse führt. PHA-Blasten wurden mit TPA und/oder Ionomycin
stimuliert und anschließend wurde die ADAM10-Oberflächenexpression
Diskussion
110
durchflusszytometrisch analysiert (Abbildung 5.5). Wie schon zuvor beschrieben
zeigte sich bei dem kombinierten Einsatz von TPA und Ionomycin ein geringer
Anstieg von membranständigem ADAM10 in den ersten 30 Minuten und
anschließend eine stetige Reduktion über die dreistündige Stimulation. Bei der
Stimulation mit TPA allein wurde ebenfalls eine geringfügige Erhöhung von ADAM10
auf der Oberfläche nach 10 Minuten detektiert. Anschließend sank die Expression
wieder auf den ursprünglichen Wert, um während der folgenden zwei Stunden leicht
anzusteigen. Der Einsatz von Ionomycin resultierte in einem ähnlichen Anstieg nach
10 Minuten mit nachfolgend konstanter Expression von ADAM10 auf der
Zelloberfläche. Die durchflusszytometrische Analyse des membranständigen FasL
zeigte für die kombinierte Stimulation mit TPA und Ionomycin das zuvor
beschriebene biphasische Profil mit einem Anstieg nach 10 Minuten und einer
erneuten Erhöhung der Oberflächenexpression nach 120-150 Minuten
(Abbildung 5.6). Die Stimulation der Zellen mit Ionomycin allein resultierte in einem
nahezu konstanten Verlauf, lediglich nach 150 Minuten gab es eine geringe
Erhöhung. Bis auf einen leichten Anstieg der FasL-Expression auf der Oberfläche
führte auch die Stimulation mit TPA allein zu einer nahezu gleichbleibenden
Expression. Für den biphasischen Verlauf der FasL-Expression (durch Mobilisierung
der sekretorischen Lysosomen und de novo Proteinbiosynthese) benötigt man
demnach den gemeinsamen Einsatz von Phorbolester und Kalziumionophor. Auch in
dem anschließend durchgeführten ELISA mit Zellkulturüberständen stimulierter
Zellen wurde deutlich, dass nur die Kombination aus beiden Faktoren zur effektiven
Proteolyse des FasL führt. Wurden PHA-Blasten allein mit TPA stimuliert, konnte
nach dreistündiger Stimulation nur ein sehr geringer Anstieg löslichen FasL
gemessen werden (Abbildung 5.7). Inkubation mit Ionomycin hingegen verstärkte die
proteolytische Prozessierung des FasL um etwa das Doppelte. Nur die kombinierte
Verwendung von TPA und Ionomycin jedoch resultierte in einem deutlichen Anstieg
der Proteolyse und große Mengen an löslichem FasL konnten detektiert werden. Aus
diesen Experimenten lässt sich schlussfolgern, dass Ionomycin allein einen geringen
Effekt auf das Shedding des FasL nimmt, während TPA keinen Einfluss zu nehmen
scheint. Durch den Einsatz beider Stimuli zusammen konnte jedoch erst eine
signifikante Proteolyserate beobachtet werden. Unklar bleibt in diesem
Zusammenhang der genaue Effekt der jeweiligen Stimuli auf molekularer Ebene.
Augenscheinlich kommt es jedoch bei der kombinierten Verwendung zu einer
Diskussion
111
Verstärkung ihrer Wirkungsweisen und einer Potenzierung der Effekte auf die FasL-
Prozessierung.
Die Steigerung der Aktivität von verschiedenen ADAM-Proteasen und dessen
Einfluss auf die Proteolyse ihrer Substrate ist seit langem im Fokus der Forschung.
Eine Vielzahl an aktivierenden Stimuli konnte bisher identifiziert werden (Reiss und
Saftig, 2009; Rose-John, 2013). Hierzu zählen bakterielle Toxine wie Streptolysin O
und Hämolysin (Walev et al., 1996), das Auftreten von Apoptose (Chalaris et al.,
2007), die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Myers et al., 2009;
Yin und Yu, 2009), Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) (Horiuchi et al., 2007; Guo
et al., 2012; Kveiborg et al., 2011) und Kalziumeinstrom durch Kalziumionophor
(Sanderson et al., 2005; Guo et al., 2012). Weiterhin wird zwischen konstitutivem und
induzierbarem Shedding unterschieden, da bei der Induktion der Proteolyse über
Verwendung bestimmter Stimuli oft auch eine andere Protease impliziert ist als bei
der konstitutiven Proteolyse. Die differenzielle Aktivierung von ADAM10 und
ADAM17 durch Ionomycin bzw. TPA wurde für viele Substrate beschrieben. So wird
das Adhäsionsmolekül L1 konstitutiv von ADAM10 prozessiert, während nach
Aktivierung der PKC primär ADAM17 für die L1-Proteolyse verantwortlich ist
(Maretzky et al., 2005; Ludwig et al., 2005). Für Pro-Betacellulin (Pro-BTC) wurde
gezeigt, dass Kalziumeinstrom über Ionomycin eine Aktivitätssteigerung von
ADAM10 bewirkte und mehr reifes BTC nachgewiesen wurde, während die
Verwendung von Phorbolester (TPA) keine erhöhte Produktion von reifem BTC
bewirkte (Sanderson et al., 2005). Für das Adhäsionsmolekül CD44 wurde
beobachtet, dass Kalziumeinstrom zu einer erhöhten Aktivität von ADAM10 führte
und die Proteolyse von CD44 stieg. Dies wurde auf eine veränderte Assoziation von
Calmodulin mit ADAM10 zurückgeführt (Nagano et al., 2004). Die Aktivierung der
Proteinkinase C (PKC) mittels Phorbolester resultierte interessanterweise auch in
dem verstärktem Shedding von CD44 durch ADAM17 (Nagano et al., 2004). Horiuchi
und Kollegen zeigten weiterhin eine Beteiligung beider Proteasen bei der
proteolytischen Prozessierung der EGFR (epidermal growth factor receptor)-
Liganden. Auch hier resultierte Ionomycin-Behandlung in der Aktivierung von
ADAM10 und Stimulation der Zellen mit TPA in der Aktivierung von ADAM17
(Horiuchi et al., 2007). Die Kurzzeitbehandlung mit TPA bewirkte keinen Einfluss auf
die Reifung von ADAM17 oder den Transport auf die Zelloberfläche. Weiterhin wurde
in dieser Veröffentlichung das Vorhandensein der zytoplasmatischen Domäne und
Diskussion
112
der Transmembranregion als Voraussetzung der Aktivitätssteigerung durch
Phorbolester ausgeschlossen, da ohne die beiden Domänen TNF-α dennoch
vermehrt prozessiert wurde (Horiuchi et al., 2007). Auch für ADAM10 wurde in dieser
Publikation ein Einfluss von Ionomycin auf die Reifung und die subzelluläre
Lokalisation ausgeschlossen. Dennoch resultierte die Deletion der intrazellulären
Domäne in einem reduzierten Shedding von EGF (epidermal growth factor) und BTC
(Horiuchi et al., 2007). Weiterhin wurde auch bei der Prozessierung von CD16b
sowohl Ionomycin-induziertes Shedding durch ADAM10 nachgewiesen, wie auch
TPA-induzierte Proteolyse durch ADAM17 (Guo et al., 2012). Die Stimulation von
Zellen mit TPA und/oder Ionomycin resultiert häufig in der Erhöhung der ADAM-
Aktivität, die genauen Umstände der Aktivierung in Bezug auf
Konformationsänderungen und folglich eventuell erleichterte Proteolyse oder aber
Änderungen der Lokalisation von Protease und Substrat auf der Plasmamembran
sind unbekannt.
ADAM17 ist ein weiteres Mitglied der ADAM-Familie und wurde als Protease des
Zytokins TNF-α identifiziert (Black et al., 1997) und wird daher auch als TNF-α-
converting enyzme (TACE) bezeichnet. Zusammen mit ADAM10 spielt ADAM17 eine
große Rolle innerhalb des Immunsystems. Obwohl die beiden Proteasen als eng
miteinander verwandte Mitglieder mehrere Gemeinsamkeiten aufweisen, zeigen sie
bezüglich ihrer aktivierungsinduzierten Oberflächenexpression auf T-Zellen große
Unterschiede. In vorhergehenden Analysen innerhalb der Arbeitsgruppe konnte
gezeigt werden, dass ADAM17 im Gegensatz zu ADAM10 auf verschiedenen T-
Zellpopulationen und Tumorzellen konstitutiv gering exprimiert ist (Diplomarbeit A.
Schröder; Ebsen et al., 2013). Interessanterweise wird auf untransformierten T-Zellen
bei TPA/Ionomycin-Stimulation nach 10 Minuten ein Anstieg von ADAM17 auf der
Zelloberfläche deutlich, der anschließend wieder rapide abnimmt. Diese induzierte
Zunahme lässt sich durch Inhibitoren der Aktinpolymerisation (Cytochalasin D,
Latrunkulin A) unterbinden (Diplomarbeit A. Schröder, Ebsen et al., 2013). In der
vorliegenden Arbeit wurden PHA-Blasten mit siRNA transfiziert, um ADAM17
transient herunter zu regulieren. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen
mit TPA und Ionomycin aktiviert und der zuvor beschriebene Anstieg an
membranständigem ADAM17 wurde in untransfizierten sowie Kontroll-RNA-
transfizierten Zellen deutlich (Abbildung 5.8). In ADAM17-siRNA-transfizierten Zellen
wurde nahezu kein Anstieg beobachtet. Die TPA/Ionomycin-induzierte
Diskussion
113
Oberflächenexpression von ADAM17 weicht völlig von der beobachteten ADAM10-
Kinetik ab, bei der über die dreistündige Stimulation fast keine Änderung gemessen
wurde. Obwohl sich beide Proteasen in ihren Fähigkeiten und Eigenschaften sonst
sehr ähneln, scheinen abweichende Regulationsmechanismen ihre induzierbare
Oberflächenexpression auf T-Zellen zu kontrollieren. Für ADAM17 ist auf Grund der
rapiden Zunahme zu Beginn der Stimulation eine Rekrutierung aus sekretorischen
Lysosomen denkbar, insbesondere da diese Mobilisierung durch Inhibitoren der
Aktinmaschinerie unterbunden werden kann. Außerdem ähneln diese
Beobachtungen sehr der Kinetik des FasL, welcher ebenfalls in Lysosomen
gespeichert und nach Aktivierung der Zellen in einem aktinabhängigen Prozess auf
die Oberfläche transportiert wird (Lettau et al., 2004). Für ADAM12 wurde gezeigt,
dass die intrazelluläre Domäne für die Speicherung im trans-Golgi-Netzwerk
vonnöten ist und das Fehlen dieser Domäne in einer verstärkten Expression auf der
Zelloberfläche resultiert (Hougaard et al., 2000). Sundberg und Kollegen berichteten
später von einer PKCε-induzierbaren Translokation von ADAM12 auf die Oberfläche
durch die Verwendung von Phorbolester (Sundberg et al., 2004). Auch für ADAM17
wurde der Effekt der PKC-Aktivierung ausgiebig analysiert. In einigen Studien konnte
kein Einfluss der Stimulation mit Phorbolester auf die Reifung und Lokalisation von
ADAM17 gezeigt werden (Doedens und Black, 2000; Schlöndorff et al., 2000;
Horiuchi et al., 2007). Nach einstündiger TPA-Stimulation wurde sogar eine
Reduktion von ADAM17 durch Internalisierung beobachtet (Doedens und Black,
2000). Andere Studien hingegen beschrieben eine schnelle Reifung und
Translokation von ADAM17 nach Phorbolesterstimulation durch Änderung des
Phosphorylierungsstatus der zytoplasmatischen Domäne (Soond et al., 2005; Göoz
et al., 2006; Bell und Göoz, 2010). Die unterschiedlichen Ergebnisse der ADAM17-
Expression nach Stimulation mit Phorbolester könnten auf der Analyse verschiedener
Zelllinien oder auch auf unterschiedlichen Einsatzkonzentrationen von TPA beruhen.
Ein weiterer Unterschied von ADAM10 und ADAM17 liegt in der differentiellen
Assoziation mit Tetraspaninen. Während ADAM10 mit einer Vielzahl von Mitgliedern
der Tetraspanin8-Subfamilie (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 und
Tspan33) und Tspan12 interagiert und von ihnen bezüglich Reifung, Expression und
Aktivität reguliert wird (Dornier et al., 2012; Haining et al., 2012; Xu et al., 2009),
wurde für ADAM17 nur die Interaktion mit CD9 nachgewiesen, welche regulierend
Diskussion
114
auf die proteolytische Aktivität wirkt (Gutiérrez-López et al., 2011). Dies könnte ein
weiterer Ansatzpunkt für die unterschiedlichen Kinetiken darstellen.
6.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter
Proteolyse
Der Nachweis, dass ADAM10 die hauptverantwortliche Protease des FasL ist, beruht
hauptsächlich auf mehr oder weniger spezifischen Inhibitoren und Untersuchungen
an transformierten Mauszellen, in denen beispielsweise die Proteasen
herunterreguliert wurden (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007). Die transiente
siRNA-Transfektion von ADAM10 und ADAM17 in untransformierten T-Zellen
erlaubte es nun, die Schlussfolgerungen zu überprüfen, indem spezifisch eine der
Proteasen reduziert wurde. PHA-Blasten wurden mit siRNA gegen ADAM10 bzw.
ADAM17 transfiziert und anschließend mit TPA/Ionomycin stimuliert. Die
durchflusszytometrische Analyse zeigte deutlich eine Reduktion von
membranständigem ADAM10 und auch in Gesamtlysaten ließ sich die effiziente
Herunterregulation nachweisen (Abbildung 5.10). Die Analyse von
Zellkulturüberständen von transfizierten, stimulierten Zellen zeigte eine verminderte
Proteolyse des FasL in ADAM10-reduzierten Zellen (Abbildung 5.11). Es wird
außerdem ersichtlich, dass allein die Transfektion der Zellen mit Kontroll-RNA bereits
zu einer verminderten Prozessierung führte, da auch hier verglichen mit den
untransfizierten Zellen weniger löslicher FasL detektiert wurde. Die
Herunterregulation von ADAM17 führte nach TPA/Ionomycin-Stimulation nicht zu
einer Reduktion der FasL-Proteolyse verglichen mit den Kontroll-transfizierten Zellen.
Auch bei der Analyse der N-terminalen Fragmente des FasL im Gesamtlysat
stimulierter Zellen wird deutlich, dass ADAM10 die Prozessierung des FasL
maßgeblich beeinflusst (Abbildung 5.12). Das Fehlen der Protease führt zu einer
Reduktion von NTFs, verglichen mit den anderen Zellen. Weiterhin akkumulieren
unprozessierte FasL-Moleküle, da sie weniger gespalten werden. Beide Experimente
zeigen, dass in TPA/Ionomycin-stimulierten Zellen ADAM10 die hauptverantwortliche
Protease darstellt. Dies steht im Einklang mit Veröffentlichungen, in denen ADAM10
als Haupt-Sheddase der konstitutiven und induzierten FasL-Proteolyse identifiziert
wurde (Kirkin et al., 2007; Schulte et al., 2007).
Diskussion
115
6.1.3 Intramembrane Proteolyse des FasL durch SPPL2a
ADAM10 schafft durch die proteolytische Spaltung des FasL auch die Möglichkeit der
regulierten intramembranen Proteolyse (RIP). In diesem Zusammenhang wurde
mittels Inhibitoren bzw. Überexpression mit anschließender Herunterregulation durch
siRNA-Transfektion SPPL2a als verantwortliche Protease nachgewiesen (Kirkin et
al., 2007). Für SPPL2a wurde als einziges Mitglied der SPPL-Familie die Lokalisation
in Lysosomen und späten Endosomen gezeigt. Dies wird durch ein Tyrosinmotiv am
C-terminalen Ende bedingt (Behnke et al., 2011). Um zu verifizieren, dass SPPL2a
an der Proteolyse der FasL-NTFs beteiligt ist, wurden PHA-Blasten mit siRNA gegen
SPPL2a transfiziert und nach 72 Stunden mit TPA und Ionomycin aktiviert. Die
nachfolgende Western Blot-Analyse (Abbildung 5.13) wies eine deutliche
Akkumulation von NTFs in Lysaten auf, bei denen SPPL2a herunterreguliert wurde.
Durch weitere Versuche mit der adhärent-wachsenden Zervixkarzinomzelllinie HeLa
konnten wir zeigen, dass die verwendeten siRNAs für die Herunterregulation von
SPPL2a geeignet sind. Allerdings waren die zugänglichen Antikörper gegen SPPL-
Proteine nicht für Analysen endogener Proteine in T-Zelllysaten geeignet, sodass die
effiziente Transfektion der Zellen nicht überprüft werden konnte. Da man aber einen
Effekt auf die FasL-Prozessierung beobachten konnte, lassen sich die Inhibitor-
basierenden Ergebnisse bezüglich des RIPpings durch SPPL2a zumindest
bekräftigen. Weitere Analysen müssten jedoch folgen, um die Spezifität der
einzelnen siRNAs zu verifizieren und um näher zu bestimmen, welche Rolle andere
Mitglieder der SPPL-Familie spielen.
6.1.4 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL
TPA und Ionomycin wurden bisher häufig für Analysen des FasL-Sheddings
verwendet, da dabei ein starker Anstieg der Proteolyse zu beobachten war. Die
Verwendung von TPA und Ionomycin jedoch resultiert in multiplen Reaktionen
innerhalb der Zelle, die im Detail weitgehend unverstanden sind. Durch die
Verwendung monoklonaler Antikörper lässt sich als physiologischer Stimulus gezielt
der TZR/CD3/CD28-Komplex von T-Zellen aktivieren. Die Verwendung des anti-CD3-
Antikörpers stellt hierbei das Signal 1 der T-Zellrezeptoraktivierung dar, während der
Antikörper gegen CD28 als zweites Signal fungiert. In einer vorhergehenden Studie
wurde eine Induktion der FasL-Proteolyse nach Stimulation von primären T-Zellen
mit anti-CD3 allein und in Kombination mit anti-CD28 gezeigt. Der Einsatz von anti-
Diskussion
116
CD28 allein hatte jedoch keinen Einfluss auf die FasL-Proteolyse (Kirkin et al., 2007).
Die Aktivierung des TZR resultiert außerdem in einem Anstieg an FasL-mRNA
(Dhein et al., 1995; Kirkin et al., 2007) und einem ansteigenden FasL-Gehalt in
CD4+- und CD8+-T-Zellen (Janssen et al., 2000b; Suda et al, 1995). In der
vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der TZR/CD3/CD28-Aktivierung auf die
Expression des FasL näher analysiert. Die Stimulation von T-Zellblasten mit
immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und CD28 resultierte in einer Induktion des
FasL-Sheddings, welches vergleichbar mit der TPA/Ionomycin-induzierten Proteolyse
war (Abbildung 5.14/5.15). Die Kinetik der ADAM10-Oberflächenexpression zeigte
bei CD3/CD28-induzierter Aktivierung von PHA-Blasten ein ähnliches Profil wie bei
Stimulation der Zellen mit TPA/Ionomycin (Abbildung 5.16). Im Verlauf der
dreistündigen Stimulation blieb die Expression von membranständigem ADAM10
zunächst nahezu konstant. Anschließend wurde ein kontinuierlicher, leichter Abfall
über die letzten beiden Stunden gemessen. Die ADAM17-Oberflächenexpression
zeigte in den ersten zwei Stunden keinen Einfluss von anti-CD3/anti-CD28 und nahm
bis zum Ende der Stimulation konstant ab (Abbildung 5.17). Diese Kinetik steht im
Gegensatz zur TPA/Ionomycin-induzierten Expression von membranständigem
ADAM17, bei der nach 10 Minuten der zuvor beschriebene rapide Anstieg zu
beobachten war (siehe oben). Folglich wären unterschiedliche Reaktionswege bei
TPA/Ionomycin- und CD3/CD28-induzierter Stimulation denkbar. Die genauen
Bedingungen der beiden Aktivierungen müssten jedoch weiter analysiert werden, um
den Grund der unterschiedlich ausgeprägten induzierbaren Expression zu erklären.
Da die Aktivierung des TZR/CD3-Komplexes auf dem Vorhandensein aktiver Src-
Kinasen beruht, wurde der Einfluss des Src-Kinase-Inhibitors PP1 (Hanke et al.,
1996) auf die TZR/CD3/CD28-induzierte FasL-Proteolyse untersucht. Durch
Inhibition Src-verwandter Tyrosinkinasen mittels PP1 wurde die proteolytische
Prozessierung des FasL nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 nahezu
komplett verhindert (Abbildung 5.18/5.19). In vorhergehenden Studien wurde bereits
gezeigt, dass bei einer Aktivierung des TZR/CD3-Komplexes ohne eine Beteiligung
der Src-Kinasen die induzierte Expression des FasL inhibiert wird (Dhein et al., 1995;
Oberg et al., 1997). Die TZR-induzierte Proteolyse des FasL setzt demnach das
Vorhandensein aktiver Src-Kinasen voraus. Die genaue Art der Interaktion von Src-
Kinasen mit dem FasL bzw. ADAM-Proteasen, z.B. über SH3-vermittelte
Wechselwirkungen, müssten in weiteren Analysen näher untersucht werden.
Diskussion
117
In vorhergehenden Studien und im Rahmen dieser Arbeit wurde ADAM10 bei
TPA/Ionomycin-Stimulation durch siRNA-Transfektion als verantwortliche Protease
identifiziert. Herunterregulation von ADAM17 zeigte hierbei keinen wesentlichen
Effekt auf die FasL-Proteolyse (Abbildung 5.11). Da ein Einfluss der Stimulation von
PHA-Blasten mit anti-CD3 und anti-CD28 auf die Expression des FasL
nachgewiesen wurde, sollte die verantwortliche Protease bezüglich des
TZR/CD3/CD28-induzierten Sheddings identifiziert werden. Spezifische
Herunterregulation mittels siRNA-Transfektion resultierte in der Reduktion von
löslichem FasL und FasL-NTFs. Interessanterweise führte auch die Transfektion von
ADAM17-siRNA zu einer noch deutlich verminderten Proteolyse
(Abbildung 5.20/5.22). Wurden ADAM10 und ADAM17 gemeinsam herunterreguliert,
wurde die geringste Prozessierung des FasL beobachtet. Im Gegensatz zur
TPA/Ionomycin-induzierten Proteolyse spielt ADAM17 beim TZR/CD3/CD28-
induzierten Shedding offensichtlich eine wesentliche Rolle und stellt hierbei eventuell
sogar die prominente Sheddase dar. Auch in diesen Versuchen wird deutlich, dass
die beiden verschiedenen Arten der Stimulation verschiedene Signalwege innerhalb
der Zelle auslösen und in der FasL-Proteolyse durch verschiedene ADAM-Proteasen
resultieren.
6.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen
6.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen
Als Hauptort der Proteolyse von membranständigen Molekülen wird die
Zelloberfläche angesehen. Es wird aber auch vermutet, dass bereits in intrazellulären
Kompartimenten Shedding stattfinden kann. Für einige Substrate von ADAM-
Proteasen konnten bereits zusätzliche Orte der Proteolyse gezeigt werden. So wurde
für das Adhäsionsmolekül L1 konstitutives Shedding durch ADAM10 in
sekretorischen Vesikeln, die Exosomen ähneln, beobachtet (Gutwein et al., 2005).
Das amyloide Vorläuferprotein APP wird bekanntermaßen auf der Plasmamembran
prozessiert, aber auch das trans-Golgi-Netzwerk (TGN) wurde als Ort der APP-
Proteolyse identifiziert (Skovronsky et al., 2000). Weiterhin wurde für Neuregulin-1
(NRG) eine intrazelluläre Proteolyse durch ADAM19 (Meltrin-β) an Stelle der
Proteolyse auf der Zellmembran vermutet (Shirakabe et al., 2001).
Diskussion
118
Die TPA/Ionomycin-induzierte Erhöhung der ADAM17-Oberflächenexpression nach
10-30 Minuten legt die Speicherung von ADAM17 in lysosomalen Kompartimenten
nahe, insbesondere da dieser Vorgang durch Inhibitoren der Aktinmaschinerie
unterbunden werden kann (Ebsen et al., 2013). Für den FasL wurde eine
Speicherung in sekretorischen Lysosomen gezeigt, welche nach Kontakt mit der
Zielzelle in einem aktinabhängigen Vorgang zur immunologischen Synapse
transportiert werden (Bossi und Griffiths, 1999; Blott et al., 2001; Lettau et al., 2004).
Um eine mögliche intrazelluläre Kolokalisation der Proteasen mit dem FasL in
sekretorischen Lysosomen zu untersuchen, wurden OptiPrepTM-basierte
Dichtegradienten nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll zur
Anreicherung lysosomaler Kompartimente (Schmidt et al., 2009) aufgetrennt und die
erhaltenen Fraktionen anschließend charakterisiert. ADAM10 und ADAM17 wurden
beide in der Fraktion 2 nachgewiesen, wo auch der FasL als Marker für sekretorische
Lysosomen detektiert wurde (Abbildung 5.23). Die erfolgreiche Auftrennung der
Gradienten wurde weiterhin durch den Nachweis weiterer Markerproteine gezeigt
(Schmidt et al., 2009). In einem weiteren Versuch wurde analysiert, ob sich die
Stimulation des TZR/CD3-Komplexes mit anti-CD3 auf die Lokalisation von ADAM10,
ADAM17 oder des FasL auswirkt. Auch hier wurden ADAM10 und ADAM17 in
derselben Fraktion wie der FasL detektiert (Abbildung 5.24). Nach Stimulation mit
anti-CD3 änderte sich die Verteilung der Proteine in den Fraktionen nicht, es wurden
jedoch zusätzliche Banden für ADAM10 und ADAM17 beobachtet. Während für
ADAM10 eine Bande auftrat, die etwa das dreifache Molekulargewicht von reifem
ADAM10 aufwies und eventuell ein Trimer von ADAM10 darstellen könnte, wurden
bei Detektion von ADAM17 deutliche Banden mit einem geringeren Molekulargewicht
beobachtet. Die Stimulation der PHA-Blasten mit anti-CD3 könnte bezüglich
ADAM17 zu einer Prozessierung der Protease in lysosomalen Kompartimenten
führen.
Die Analysen der Dichtegradienten zeigten, dass sowohl ADAM10 als auch ADAM17
in T-Zellen in lysosomalen Kompartimenten lokalisiert sind und eventuell schon hier
mit dem FasL zusammentreffen. Ob diese Vesikel innerhalb der Zelle bereits Ort der
proteolytischen Prozessierung des FasL sein können, muss in weiteren Analysen
untersucht werden. Außerdem muss der Effekt der TZR/CD3-Aktivierung auf
ADAM10 und ADAM17 näher analysiert werden, um die Identität der entstehenden
Banden zu erklären.
Diskussion
119
6.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation
Wie für den FasL gezeigt wurde, hängt die Induktion von Apoptose von der
Lokalisation in Cholesterol-angereicherten Mikrodomänen (Lipid Rafts) ab und
dessen Auflösung führt zu verminderter Zytotoxizität (Scheel-Toellner et al., 2002;
Cahuzac et al., 2006; Nachbur et al., 2006). Für diese Lokalisation ist die
intrazelluläre Domäne des FasL essentiell, was eine Beteiligung von regulatorischen
SH3-Domäne-Proteinen wahrscheinlich macht (Cahuzac et al., 2006). Als weiterer
möglicher Ort der FasL-Proteolyse mit der prozessierenden ADAM-Protease wurde
deshalb eine Lokalisation in lipidhaltigen Signalplattformen der Plasmamembran
untersucht.
Diese Domänen zeichnen sich durch einen hohen Gehalt an Cholesterol und
Sphingolipiden aus und weisen folglich eine hohe Fluidität auf. Die Isolierung
lipidhaltiger Mikrodomänen kann durch Behandlung der Zellen mit kaltem Triton X-
100-Lysepuffer erfolgen. Als Detergenz-resistente Membranen (DRMs) wandern die
Lipid Rafts durch ihre geringe Dichte in einem Dichtegradienten in die leichteren
Fraktionen. In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen in 1% Triton X-100 lysiert und
das Lysat anschließend über Sucrose-Dichtegradienten aufgetrennt. Die erhaltenen
Fraktionen wurden mittels Western Blot analysiert. In Lysaten unstimulierter T-Zellen
(PHA-Blasten und Jurkat-Zellen) wurde ADAM10 und ADAM17 ausschließlich in
Fraktionen großer Dichte am Boden des Gradienten nachgewiesen, während der
FasL zu einem geringen Anteil auch in Fraktionen geringer Dichte lokalisiert war
(Abbildung 5.25A/5.26A). Dies zeigt für unstimulierte Zellen eine räumliche Trennung
des FasL von den beiden Proteasen. Nach Stimulation des TZR/CD3-Komplexes
allerdings wurde eine Verschiebung von schweren zu leichten Fraktionen von
ADAM10, ADAM17 und auch dem FasL beobachtet (Abbildung 5.25B/5.26B). Die
Inhibierung von Src-Kinasen, die Raft-assoziiert sind und daher als Marker für DRMs
verwendet werden, resultierte in einer deutlichen Reduktion der Verschiebung nach
Behandlung der Zellen mit anti-CD3 (Abbildung 5.27). Dies zeigt, dass für die
aktivierungsinduzierte Translokation von ADAM10, ADAM17 und des FasL aktive
Src-Kinasen vorhanden sein müssen.
Zusätzlich wurden Zellen vor der Stimulation mit Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD)
behandelt. MβCD führt zur Extraktion von Cholesterol aus den Zellen und
nachfolgend zur Zersetzung der Signalplattformen. Hierdurch kann sichergestellt
Diskussion
120
werden, dass es sich bei den isolierten Mikrodomänen um Cholesterol-angereicherte
Lipid Rafts handelt. Nach Behandlung der Zellen mit MβCD war eine reduzierte
Verschiebung von ADAM10 und dem FasL nachweisbar und auch der DRM-Marker
Lck wurde weniger abundant in leichten Fraktionen detektiert (Abbildung 5.28). Die
Behandlung der Zellen mit MβCD war demnach erfolgreich und es handelte sich bei
der Isolation um eine Anreicherung von DRMs. In einer vorhergehenden Studie
wurde der unprozessierte FasL in leichten und schweren Fraktionen detektiert,
während FasL-NTFs ausschließlich in Fraktionen geringer Dichte detektiert wurden.
Für ADAM10 konnte gezeigt werden, dass lediglich die reife Form in leichten
Fraktionen lokalisiert war. Zersetzung der Rafts durch Cholesteroloxidase resultierte
in einer geringeren Proteolyse des FasL und folglich weniger FasL-NTFs in leichten
Fraktionen (Guardiola-Serrano et al., 2010).
Zu den posttranslationalen Modifikationen, die die Lokalisation in Lipid Rafts
begünstigen, gehören die Addition von GPI-Ankern, Palmitoylierungen oder
Myristoylierungen. Es wurde bereits gezeigt, dass das FasL-Shedding die
Palmitoylierung der Aminosäure 82 voraussetzt, eine Interaktion von ADAM10 mit
dem FasL davon jedoch unabhängig ist (Guardiola-Serrano et al., 2010). In einem
weiteren Versuch wurde die Bedeutung von Palmitoylierungen auf die TZR/CD3-
induzierte Translokation der Proteasen und dem FasL analysiert, indem die Zellen
vor der Stimulation mit dem Palmitoylierungsinhibitor 2-Brompalmitat (2BP)
behandelt wurden. Trotz der Behandlung wurden ADAM10 und ADAM17 nach der
Stimulation mit anti-CD3 in leichten Fraktionen nachgewiesen und schienen sogar
leicht verstärkt in DRMs lokalisiert zu sein. Auch der FasL wurde nach der Inkubation
mit 2BP verstärkt in Fraktionen geringer Dichte detektiert (Abbildung 5.29). Lediglich
die Raft-assoziierte Src-Kinase Lck zeigte eine geringere Abundanz in 2BP-
behandelten Zellen. Es wurde bereits u.a. für Lck beschrieben, dass die Behandlung
mit 2BP zum Verlust der Raft-Assoziation führt, da die Palmitoylierung von Lck
essentiell für die Lokalisation in DRMs ist (Webb et al., 2000). Auch für die NKG2D-
Liganden MICA/B (MHC-class-I-related chain A/B) konnte eine reduzierte Proteolyse
nach 2BP-Behandlung nachgewiesen werden (Buotet et al., 2009; Agüera-González
et al., 2011). Der Einfluss von Palmitoylierungen auf die Proteolyse wurde auch für
TNF-α gezeigt, jedoch bewirkt sie in diesem Beispiel eine Inhibition des RIPpings des
membranständigen Fragments, nicht jedoch des Sheddings durch ADAM17 (Poggi et
al., 2013).
Diskussion
121
Eine weitere posttranslationale Modifikation, die zu einer Lokalisation von
Membranproteinen in lipidhaltigen Mikrodomänen beitragen kann, ist die Addition
einer Myristinsäure an N-terminale Glycinreste, auch Myristoylierung genannt. Diese
Modifikation kann durch die Zugabe von 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) inhibiert
werden. In der TZR/CD3-induzierten Translokation der betrachteten ADAM-
Proteasen und des FasL konnte jedoch eher eine Verstärkung der Lokalisation in
leichten Fraktionen nach 2HMA-Behandlung festgestellt werden (Abbildung 5.30).
Folglich scheinen Myristoylierungen nicht an der veränderten Lokalisation oder der
gesteigerten Aktivität der Proteasen beteiligt zu sein.
Der Einfluss der verschiedenen Inhibitoren sollte auch bezüglich der FasL-Proteolyse
analysiert werden. CD4+-T-Zellen wurden entsprechend behandelt und anschließend
mit anti-CD3/anti-CD28 stimuliert. Die FasL-Prozessierung wurde durch Detektion
von FasL-NTFs und sFasL analysiert. Cholesteroldepletion durch MβCD resultierte in
einer starken Verminderung von NTFs, ebenso wie die Inhibition von
Palmitoylierungen über 2BP (Abbildung 5.31/32). Die kombinierte Inhibition von
Myristoylierungen durch 2HMA und Palmitoylierung durch 2BP zeigte die stärkste
Reduktion der FasL-Fragmente, während die Inkubation mit 2HMA allein keinen
Effekt hatte (Abbildung 5.31/32). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass weder
Palmitoylierung noch Myristoylierung die Translokation von ADAM10, ADAM17 oder
des FasL bedingt, da die Inhibition einer der Modifikationen keine Änderung bewirkt.
Trotzdem scheinen Palmitoylierungen bei dem TZR/CD3/CD28-induziertem
Shedding eine Rolle zu spielen, da die Proteolyse des FasL bei 2BP-Behandlung
stark reduziert ist. Dies könnte jedoch auch sekundär bedingt an der verminderten
Raft-Assoziation der Kinase Lck oder anderer Mitglieder der Src-Familie liegen, die
bei der TZR-Aktivierung auch im Kontext des FasL-Sheddings eine wichtige Rolle
einnehmen.
Die Lokalisation und Aktivität der ADAM-Proteasen in Bezug auf ein bestimmtes
Substrat scheint stark zwischen verschiedenen Zelltypen zu variieren. So wurde für
eine Vielzahl von Substraten und deren ADAM-Proteasen eine differentielle
Lokalisation gezeigt. Häufig wurde für ADAM10 und ADAM17 eine Lokalisation
außerhalb und für die Substrate innerhalb der Cholesterol-angereicherten
Signalplattformen beobachtet. ADAM10 wurde im Zusammenhang mit dem
Adhäsionsmolekül CD44 in Triton X-100-löslichen Fraktionen detektiert (Murai et al.,
Diskussion
122
2011), ebenso wie in Bezug auf APP (Kojro et al., 2001), L1-CAM (Mechtersheimer
et al., 2001) und dem IL6R (Matthews et al., 2003). Auch ADAM17 wurde oft in
schweren Fraktionen getrennt von dem jeweiligen Substrat nachgewiesen, z.B. für
CD30 (von Tresckow et al., 2004), Kollagen XVII (Zimina et al., 2005) und dem IL6R
(Matthews et al., 2003). In den erwähnten Studien führte die Depletion von
Cholesterol stets zu einer Erhöhung der Proteolyse durch Aufhebung der räumlichen
Trennung von Substrat und Enzym. Für TNF-α und die beiden Rezeptoren TNFR1
und TNFR2 konnte das ADAM17-vermittelte Shedding ebenfalls als Raft-assoziiert
nachgewiesen werden, jedoch wurde hier ADAM17 auch in leichten Fraktionen
detektiert (Tellier et al., 2006; D’Alessio et al., 2012). ADAM19 (Meltrin-β) wurde
ebenfalls in Rafts lokalisiert und das Shedding von Neuregulin-1 als Raft-abhängiges
beschrieben (Wakatsuki et al., 2004). Parr-Sturguess und Kollegen wiesen auch ein
Vorkommen von ADAM17 in Lipid Rafts nach, jedoch ist die Proteolyse des Notch-
Liganden Jagged1 durch ADAM17 nicht Raft-assoziiert (Parr-Sturgess et al., 2010).
Die Proteolyse von CD154 (CD40-Ligand) wurde ebenfalls als Raft-unabhängig
beschrieben (Yacoub et al., 2013). Auch wenn die Lokalisationen von Substraten und
ADAM-Proteasen stark voneinander abweichen, zeigt der aufgeführte Vergleich eine
wichtige Beteiligung von lipidhaltigen Mikrodomänen zur Regulation des Sheddings
durch räumliche Trennung. In T-Zellen konnte ebenfalls eine große Rolle von Lipid
Rafts in der Prozessierung des FasL gezeigt werden, da bei ihrer Auflösung die CD3-
induzierte Proteolyse inhibiert wurde.
6.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10
SH3-Domäne-Proteine ermöglichen durch Bindung an Proteine mit Prolin-reichen
Bindungsstellen die gezielte Regulierung der gebundenen Proteine in Bezug auf
dessen Expression, Lokalisierung und Aktivität. Für ADAM-Proteasen wurde bereits
eine Vielzahl von Interaktionspartnern mit SH3-Domänen identifiziert, die teilweise
regulatorisch auf die Protease wirken. Auch der FasL interagiert mit SH3-Domäne-
Proteinen, die seine subzelluläre Lokalisation beeinflussen (Voss et al., 2009).
Außerdem wurden für die unterschiedlichen Fragmente des FasL differentielle
Interaktionen mit PACSINen und SNXen nachgewiesen (Lettau et al., 2014). Im
Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden interagierende SH3-Domänen von ADAM10
analysiert. Humanes ADAM10 enthält in der intrazellulären Region zwei potentielle
SH3-Bindungsmotive (AS 708-717, PKLPPPKPLP; und AS 722-728, RRRPPQP;
Diskussion
123
siehe Abbildung 1.4) zur möglichen Interaktion mit SH3-Domänen. Durch die
Verwendung einer kommerziell erhältlichen Phagenbibliothek (All SH3 Domain
Phager®) mit allen 305 humanen SH3-Domänen konnten in zwei separaten Ansätzen
38 SH3-Domänen als potentielle Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne
von ADAM10 identifiziert werden (Abbildung 5.36, Tabelle 5.1). Die meisten
Kandidaten wurden jedoch nur ein- (27 Klone) oder zweimal (8 Klone) identifiziert.
Am häufigsten wurde die SH3-Domäne des endozytotisch relevanten Proteins
Endophilin-A2 (8 Klone), der Src-verwandten Tyrosinkinase Lck (5 Klone) und der
Palmitoylierungstransferase ZDHHC6 (3 Klone) identifiziert. Die Anzahl identifizierter
Klone spiegelt nicht automatisch die Bindungsspezifität der SH3-Domäne an den
intrazellulären Teil von ADAM10 wieder. Theoretisch sollten alle Phagen mit den
entsprechenden SH3-Domänen in gleicher Zahl in der Phagenbibliothek vorhanden
sein, dennoch können Unterschiede in der Häufigkeit der Klone auftreten. Außerdem
wurde trotz stringentem Waschens der Beads eine Vielzahl verschiedener SH3-
Domänen nachgewiesen, die mit dem Kontrollprotein GST präzipitiert wurden. Dies
könnte an dem relativ großen Anteil GST (234 AS) im Verhältnis zur
zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 (51 AS) liegen. SH3-Domänen, die mit
GST und GST-ADAM10(697-748) präzipitierten (Tabelle A1), wurden bei der
nachfolgenden Analyse zunächst nicht berücksichtigt. Die für ADAM10 identifizierten
SH3-Domänen gehören u.a. zu verschiedenen Familien von Adapterproteinen,
Tyrosinkinasen und Palmitoyltransferasen. Viele der Proteine wurden bereits in
vorhergehenden Studien als Interaktionspartner anderer ADAM-Proteasen
identifiziert.
Endophiline
Die SH3-Domäne von Endophilin-A2 (SH3GL1, EEN) wurde in 8 Klonen von GST-
hADAM10(697-748)-Präzipitaten nachgewiesen. Endophilin-A2 ist ein Mitglied der
Endophilin-Familie, die N-terminal eine Bin-Amphiphysin-Rvs-Domäne und C-
terminal eine SH3-Domäne aufweisen. Sie sind zytoplasmatische Proteine, die bei
Endozytoseprozessen über ihre N-BAR-Domäne die Krümmung der Membran
beeinflussen (de Heuvel et al., 1997; Ringstad et al., 1997; Peter et al., 2004; Gallop
et al., 2006). Endophilin-A2 wird im Gegensatz zu Endophilin-A1 und –A3 ubiquitär
exprimiert (Ringstad et al., 1997). Endophilin-A1 wurde in einem Yeast-Two-Hybrid-
Screen und nachfolgenden Pull-Down-Analysen und Ko-Immunpräzipitationen
Diskussion
124
bereits als Interaktionspartner von ADAM9 und ADAM15 identifiziert,
interessanterweise jedoch nur mit den unreifen Formen (Howard et al., 1999). In
diesem Zusammenhang wurde für Endophilin-A1 eine regulatorische Rolle bezüglich
der Reifung, Lokalisation und folglich der Aktivität der ADAM-Proteasen vermutet.
Zur Verifizierung der Interaktion von Endophilin-A2 mit der zytoplasmatischen
Domäne von ADAM10 wurden Pull-Down-Analysen mit der SH3-Domäne von
Endophilin-A2 durchgeführt. Die unreife Form von ADAM10 wurde mit der SH3-
Domäne von Endophilin-A2/EEN präzipitiert, die reife Form konnte jedoch nicht
nachgewiesen werden (Abbildung 38A). Wie zuvor für Endophilin-A1 und
ADAM9/ADAM15 gezeigt wurde, weist die Bindung von Endophilin-A2 an die unreife
Form von ADAM10 auf eine mögliche regulatorische Funktion bezüglich der Reifung
von ADAM10 hin. Die Interaktion wurde zusätzlich mit Ko-Immunpräzipitationen von
mADAM10- und EEN-transfizierten HEK293T-Zellen bekräftigt. Da die intrazelluläre
Domäne von murinem ADAM10 lediglich in einer Aminosäure außerhalb der Prolin-
reichen Region von der humanen Domäne abweicht, konnte für die Versuche das
vorhandene murine Konstrukt verwendet werden. ADAM10 konnte mit Endophilin-
A2/EEN präzipitiert werden und auch EEN wurde in Präzipitaten von ADAM10
nachgewiesen (Abbildung 5.38B). Die genaue Funktion der Interaktion, insbesondere
auf die Reifung von ADAM10, muss jedoch in weiteren Experimenten näher
analysiert werden.
Src-verwandte Tyrosinkinasen
In der Analyse interagierender SH3-Domänen der intrazellulären Region von
ADAM10 wurden die Tyrosinkinasen Lck, Src und Abl identifiziert. Die Src-Familie
umfasst neun Mitglieder (Blk, Fgr, Frk, Fyn, Hck, Lck, Lyn, Src, Yes), die zytosolisch
bzw. membranständig (assoziiert mit Lipid Rafts) lokalisiert sind und bei
verschiedenen Signaltransduktionsprozessen, u.a. der Aktivierung von T-und B-
Zellen, eine wichtige Rolle einnehmen (Lowell, 2011). Abl ist eine verwandte
Tyrosinkinase. Neben der Beteiligung bei Migration, Adhäsion und Apoptose von
Zellen trägt sie durch Phosphorylierungen von Rezeptortyrosinkinasen wie dem
EGFR zum TZR-Signalweg bei (Tanos und Pendergast, 2006; Gu et al., 2009). Die
Interaktion von ADAM10 mit verschiedenen Mitgliedern der Src-Familie und Abl
konnte durch Pull-Down-Experimente gezeigt werden (Abbildung 5.39). Zusätzlich
Diskussion
125
wurde aus T-Zelllysaten endogenes ADAM10 mit Lck immunpräzipitiert
(Abbildung 5.40).
Für mehrere ADAM-Proteasen sind bereits Interaktionen mit Src-Kinasen beobachtet
worden. So wurde für den intrazellulären Teil von ADAM12 eine Bindung von Src und
die Phosphorylierung durch Src nachgewiesen (Kang et al., 2000; Suzuki et al.,
2000). Weiterhin wurden Src, Lck, Fyn und Abl als Interaktionspartner der
zytoplasmatischen Region von ADAM15 identifiziert (Poghosyan et al., 2002). Durch
die Stimulation der Zellen mit Phorbolester wurde eine ansteigende Phosphorylierung
von ADAM15, assoziiert mit einer erhöhten Bindung der Kinasen, gezeigt.
Dephosphorylierung resultierte in einer verminderten Bindung von ADAM15 an die
Kinasen Lck, Hck und Fyn sowie das Adapterprotein Grb2. In diesem
Zusammenhang wurde die direkte Phosphorylierung von ADAM15 durch Hck und
Lck nachgewiesen (Poghosyan et al., 2002).
Die Palmitoylierungstransferase ZDHHC6
Die SH3-Domäne der Palmitoylierungstransferase ZDHHC6 (zink finger DHHC
domain-containing protein 6) wurde in der Analyse interagierender SH3-Domänen
dreimal identifiziert. ZDHHC6 gehört zu der wenig erforschten Familie der DHHC-
Palmitoylierungstransferasen. Wie bereits erwähnt kann Palmitoylierung als
posttranslationale Modifikation eine Lokalisation in lipidhaltigen Mikrodomänen
bewirken, aber auch die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen wird hierdurch
beeinflusst. So wird das ER-Protein Calnexin durch die ZDHHC6 modifiziert und in
das raue ER transloziert (Lakkaraju et al., 2012) und auch für Abl wurde eine
Interaktion mit ZDHHC16 beschrieben (Li et al., 2002). Palmitoylierungen von ADAM-
Proteasen sind bisher nicht beschrieben. Wie jedoch im Rahmen dieser Arbeit
gezeigt wurde, spielt Palmitoylierung als posttranslationale Modifikation eine Rolle
bei der Prozessierung des FasL, da eine Inhibition durch 2BP zu einer Reduktion des
Sheddings führt. Weiterhin wurde in einer früheren Studie die Palmitoylierung der
Aminosäure 82 des FasL als essentiell für die Zytotoxizität und die Proteolyse durch
ADAM10 und SPPL2a nachgewiesen (Guardiola-Serrano et al., 2010). Auch für viele
andere Substrate von ADAM-Proteasen wurde der Einfluss von Palmitoylierungen
zur Regulation der Proteolyse deutlich. Die Prozessierung von MICA/B (MHC-class-I-
related chain A/B) durch die Lokalisation in Cholesterol-angereicherten
Mikrodomänen wird auch durch Palmitoylierung reguliert und die Inhibition von
Diskussion
126
Palmitoylierungen reduzierte die Proteolyse (Buotet et al., 2009; Agüera-Gonzalez et
al., 2011). In Bezug auf die Regulation von ADAM10 konnte beobachtet werden,
dass nur palmitoyliertes Tetraspanin12 an ADAM10 bindet und dessen Lokalisation
und Reifung beeinflusst, was wiederum die Proteolyse von APP beeinträchtigt (Xu et
al., 2009).
Die Palmitoylierungstransferase ZDHHC6 könnte demnach nicht nur direkt auf
ADAM10 Einfluss nehmen, sondern auch über verschiedene Substrate und
regulatorische Proteine. Durch das Fehlen geeigneter Antikörper und Reagenzien
konnte leider keine Verifizierung der Interaktion erfolgen und die Relevanz der
Interaktion von ADAM10 und ZDHHC6 kann nur hypothetisch analysiert werden.
Grb2-Adapterproteine
Adapterproteine fungieren in der Zelle bei Signaltransduktionsprozessen, indem sie
durch ihre verschiedenen Interaktionsmodule andere Proteine miteinander in
Verbindung bringen und so zur Formierung von Proteinkomplexen beitragen (Chardin
et al., 1995; Leo et al., 2002). Die Grb2-Proteinfamilie besteht aus drei Mitgliedern
(Grb2, GRAP und GRAP2). Während Grb2 in einer Vielzahl von Zellen exprimiert ist,
beschränkt sich die Expression von GRAP und GRAP2 auf hämatopoetische Zellen.
Alle drei Mitglieder sind aus zwei flankierenden SH3- und einer mittleren SH2-
Domäne aufgebaut, wodurch die gleichzeitige Interaktion mit mehreren Proteinen
ermöglicht wird (Chardin et al., 1995).
In der Analyse interagierender SH3-Domänen wurden die SH3-Domänen von Grb2
(2 Treffer) und GRAP2 (1 Treffer) in Präzipitaten des GST-hADAM10(697-748)-
Fusionsproteins identifiziert, nicht jedoch in Präzipitaten des Kontrollproteins GST.
Die Verifizierung der Interaktion erfolgte mittels Pull-Down und Ko-
Immunpräzipitationen (Abbildung 5.41). In der Pull-Down-Analyse wurde eine
bevorzugte Bindung von ADAM10 an die C-terminalen SH3-Domänen von Grb2,
GRAP und GRAP2 beobachtet. Auch für andere ADAM-Mitglieder wurde bereits eine
Interaktion mit Grb2-Proteinen nachgewiesen. In einer Studie konnte ADAM12 durch
Präzipitation von Grb2 kopräzipitiert werden (Suzuki et al., 2000). Später wurde die
Internalisierung von ADAM12 als Grb2-abhängig beschrieben (Stautz et al., 2012).
Auch ADAM15 wurde als Interaktionspartner von Grb2 identifiziert und
Dephosphorylierung resultierte in verminderter Bindung von Grb2 (Poghosyan et al.,
Diskussion
127
2002), was eventuell durch eine Beteiligung von SH2-Domänen zu erklären ist, da
diese phosphorylierte Tyrosingruppen binden.
PACSINe
Eine weitere Proteinfamilie, die an Exo- und Endozytoseprozessen beteiligt ist, ist die
PACSIN-(PKC and casein kinase substrate in neurons)Familie. In der Analyse
interagierender SH3-Domänen wurde PACSIN3 als potentiell interagierendes Protein
von ADAM10 identifiziert. PACSINe gehören zur Gruppe der PCH-(pombe Cdc15
homology-) Proteine. Sie weisen, ähnlich den Endophilinen, eine F-BAR-Domäne
auf, mit der sie die Membrankrümmung und folglich die Endo- und Exozytose
beeinflussen (Chitu und Stanley, 2007; Aspenström, 2009). Über Pull-Down-
Analysen wurde die Interaktion von ADAM10 mit den drei Mitgliedern der PACSIN-
Familie verifiziert (Abbildung 5.42/43). Interessanterweise fiel die Interaktion von
ADAM10 und ADAM17 mit PACSIN3 verstärkt aus. Eine bevorzugte Bindung an
PACSIN3 müsste jedoch in zusätzlichen Analysen näher untersucht werden.
Andere ADAM-Proteasen wurden zuvor ebenfalls als interagierende Proteine der
PACSINe beschrieben. Die erste Interaktion wurde für ADAM13 mit X-PACSIN2 in
Xenopus-Embryos gezeigt und die Überexpression von X-PACSIN2 konnte die
Defekte der Embryogenese durch die endogene Expression von ADAM13 aufheben
(Cousin et al., 2000). Weiterhin wurde eine Interaktion von PACSIN3 und ADAM12
zunächst in einem Yeast-Two-Hybrid-Screen gezeigt und anschließend durch Pull-
Down-Analysen und Immunpräzipitationen bekräftigt (Mori et al., 2003). Die
Überexpression von PACSIN3 resultierte in verstärkter Proteolyse des EGF-
ähnlichen Wachstumsfaktor (proHB-EGF); Herunterregulation reduzierte das
Shedding (Mori et al., 2003).
Sorting Nexine
Eine weitere Proteinfamilie, die im Rahmen dieser Arbeit analysiert wurde, ist die
Familie der Endozytose-relevanten Sorting Nexine (SNXe). Sie werden ubiquitär
exprimiert und fungieren als Adapterproteine zur Regulation der Endozytose,
Signaltransduktion und intrazellulären Lokalisation von Proteinen. Die SNX9-
Subfamilie besteht aus drei Mitgliedern (SNX9, SNX18, SNX33), die jeweils eine
SH3-Domäne und eine insgesamt hohe Sequenzhomologie aufweisen. Sie besitzen
wie die Endophiline eine N-BAR-Domäne, mit der sie die Membrankrümmung
Diskussion
128
beeinträchtigen (Cullen, 2008; Cullen und Korswagen, 2012). SNX9 trägt u.a. zur
Internalisierung des TNF-Rezeptors (TNFR) und dem Abbau des EGF-Rezeptors
nach Signaltransduktion über EGF (Lin et al., 2002).
In vorhergehenden Studien wurden bereits andere Mitglieder der SNXe als
Interaktionspartner von ADAM-Proteasen identifiziert. SNX9 interagierte ebenso wie
Endophilin-A1 mit den unreifen Formen von ADAM9 und ADAM15 (Howard et al.,
1999). In einer weiteren Veröffentlichung wurde von einer Interaktion von SNX33 mit
der Prolin-reichen Region von ADAM15 berichtet (Kleino et al., 2009). Auch im
Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Mitglied der SNXe, SNX18, als
potentiellen Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne von ADAM10
identifiziert. Die Interaktion von ADAM10 mit SNX18 und auch SNX9 und SNX33
konnte durch Pull-Down-Analysen mit Lysaten überexprimierter SNXe verifiziert
werden (Abbildung 5.44).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Vielzahl von SH3-Domäne-Proteinen
als Interaktionspartner verifiziert. Mehrere der in vitro mit ADAM10 interagierenden
SH3-Domäne-Proteine wurden in vorhergehenden Studien auch als
Interaktionspartner des FasL identifiziert. Dazu zählen die Tyrosinkinasen Fgr, Fyn,
Lyn, Src, Tec and Yes (Wenzel et al., 2001, Voss et al., 2009), Mitglieder der Grb2-
Adapterproteine (Wenzel et al., 2001; Ghadimi et al., 2002), PACSINe (Ghadimi et
al., 2002; Qian et al., 2006) und SNXe (Thornhill et al., 2007; Voss et al., 2009). Viele
dieser Interaktionen zeigen Einfluss auf die Speicherung des FasL in intrazellulären
Vesikeln oder sind bei der aktivierungsinduzierten Mobilisierung des FasL auf die
Zelloberfläche beteiligt (Baum et al., 2005; Qian et al., 2006; Lettau et al., 2006). Eine
gemeinsame Regulation des FasL mit der verantwortlichen ADAM-Protease wäre
denkbar, insbesondere auch da eine differentielle Interaktion der unprozessierten
Form des FasL und FasL-NTFs mit SNXen und PACSINen beobachtet wurde (Lettau
et al., 2014). In diesem Zusammenhang wäre interessant, ob das unprozessierte
ADAM10 ebenfalls andere Bindungen eingeht als die durch ADAM9 und ADAM15
gespaltenen Fragmente. Die funktionelle Relevanz der Bindungen für die Aktivität
von ADAM10 (und ADAM17) in T-Zellen muss insbesondere, auch bezüglich der
FasL-Proteolyse, nachfolgend durch z.B. Überexpressionsstudien oder
Herunterregulation der interagierenden Proteine analysiert werden.
Diskussion
129
6.4 Proteolyse als posttranslationale Modifikation kontrolliert die
Expression des FasL
Vor dem Hintergrund der im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten lässt sich
zusammenfassen, dass eine Regulation der Expression des FasL bei
TPA/Ionomycin-induzierter Proteolyse durch ADAM10 und bei anti-CD3/CD28-
induzierter Proteolyse durch ADAM10 und ADAM17 erfolgt. Die beiden
Metalloproteasen unterscheiden sich bezüglich ihrer Kinetiken nach Stimulation mit
TPA/Ionomycin, haben jedoch eine TZR/CD3-induzierte Translokation in Cholesterol-
angereicherte Mikrodomänen gemeinsam, wo sie auf den angereicherten FasL
treffen. Der Anstieg der FasL-Prozessierung lässt sich durch Cholesteroldepletion,
Inhibition von Src-Kinasen und Reduktion von Palmitoylierungen verringern.
Bei der Regulation der Oberflächenexpression von ADAM10 und ADAM17 nach
TPA/Ionomycin- bzw. TZR/CD3/CD28-Stimulation ist eine Rolle von SH3-Domäne-
Proteinen sehr wahrscheinlich. Viele der identifizierten SH3-Domänen gehören zu
Proteinfamilien, die als Adapterproteine bei Endo- und Exozytoseprozessen
fungieren. Dies könnte auf eine mögliche Regulation der ADAM-Proteasen durch
Internalisierung hindeuten. In einem weiteren Ansatz im Rahmen dieser Arbeit wurde
die intrazelluläre Speicherung der Proteasen in sekretorischen Lysosomen
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ADAM10 und auch ADAM17 in
derselben Fraktion wie der FasL lokalisiert sind, was auf eine Speicherung in
lysosomalen Kompartimenten hindeutet. Auch bei der Sortierung von ADAM10
und/oder ADAM17 in intrazelluläre Speicherorganellen könnten SH3-Domäne-
Proteine eine Rolle spielen.
Ein hypothetisches Szenario der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur
Regulation des FasL durch Proteolyse als posttranslationale Modifikation ist in
Abbildung 6.1 dargestellt. Die detaillierte Charakterisierung der Proteolyse des FasL
durch ADAM10 und ADAM17 nach TZR-Aktivierung, insbesondere im Hinblick auf
subzelluläre Lokalisation, induzierte Oberflächenexpression und der Regulation der
Aktivität durch Interaktionen mit SH3-Domäne-Proteine sind vonnöten, um das
Wissen bei einer Fehlregulation des Fas/FasL-Systems für Therapiezwecke nutzen
zu können.
Diskussion
130
Abb. 6.1: Proteolyse als posttranslationale Modifikation reguliert die Expression des FasL. Nach der Translation im Nukleus wird die ADAM-Protease im Endoplasmatischen Retikulum (ER) translatiert und das Signalpeptid vor der Translokation in das trans-Golgi-Netzwerk (TGN) abgespalten. Zur weiteren Reifung wird die N-terminale Prodomäne durch Proproteinkonvertasen (z.B. Furin) proteolytisch entfernt. Eine mögliche Speicherung von ADAM10/17 könnte durch die Interaktion mit SH3-Domäne-Proteine in sekretorischen Lysosomen erfolgen, in denen auch der FasL lokalisiert ist. Auch der Transport auf die Zelloberfläche und die proteolytische Aktivität kann durch regulatorische Proteine mit SH3-Domänen kontrolliert werden. In Lipid Rafts oder Tetraspanin-Plattformen trifft ADAM10/17 wahrscheinlich auf den FasL. Nach der Proteolyse wird ein lösliches Fragment freigesetzt, das autokrin oder parakrin binden kann. Internalisierung von ADAM10/17, eventuell auch unter Beteiligung von SH3-Domäne-Proteinen, oder Shedding durch andere ADAM-Proteasen (z.B. von ADAM10) kann die Oberflächenexpression regulieren. Intramembrane Proteolyse des C-terminalen Fragments (CTF) resultiert in der Freisetzung der intrazellulären Domäne (ICD) in das Zytosol. Modifiziert nach: Ebsen et al., 2014.
Zusammenfassung
131
7. Zusammenfassung
Der Fas-Ligand besitzt als Todesfaktor der TNF-Familie die Fähigkeit, durch Bindung
an seinen Rezeptor Apoptose in Fas-tragenden Zellen zu induzieren. Die Expression
des FasL muss daher zu jedem Zeitpunkt streng reguliert werden. Proteolyse durch
die Metalloprotease ADAM10 wurde in vorhergehenden Studien als eine
posttranslationale Modifikation des FasL zur Kontrolle der Expression identifiziert.
Die Stimulation mit Phorbolester (TPA) und Kalziumionophor (Ionomycin) wird häufig
zur induzierten Proteolyse des FasL verwendet. Es konnte im Rahmen der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass nur die Kombination der beiden Faktoren
zu einer Abnahme von membranständigem/reifem ADAM10 und einem deutlichen
Anstieg der FasL-Proteolyse resultiert. Durch spezifische Herunterregulation von
ADAM10 oder ADAM17 wurde für die TPA/Ionomycin-induzierte FasL-Proteolyse
ADAM10 als verantwortliche Protease identifiziert.
Weiterhin wurde der Einfluss der physiologischen Stimulation des TZR/CD3-
Komplexes und CD28-Kostimulation auf die Prozessierung des FasL untersucht.
Eine Aktivierung mit Antikörpern gegen CD3/CD28 resultierte in dem verstärkten
Shedding des FasL, vergleichbar mit der Stimulation mit Phorbolester und
Kalziumionophor. Dieser proteolytische Anstieg konnte durch Inhibition von Src-
Kinasen verhindert werden. Zusätzlich wurde durch transiente Herunterregulation für
die TZR/CD3/CD28-induzierte Proteolyse eine Beteiligung von ADAM10 und von
ADAM17 nachgewiesen.
Die subzelluläre Lokalisation der endogenen Proteasen ADAM10 und ADAM17 in T-
Zellen wurde bislang unzureichend untersucht. Die aktinabhängige, TPA/Ionomycin-
induzierbare Erhöhung der ADAM17-Oberflächenexpression deuten auf intrazelluläre
Speichervesikel hin, in denen auch der FasL als Marker für sekretorische Lysosomen
lokalisiert ist. Um die eventuelle Speicherung von ADAM10 und/oder ADAM17 in
lysosomalen Kompartimenten und eine eventuelle intrazelluläre Kolokalisation des
FasL mit ADAM10/17 zu untersuchen, wurden sekretorische Granula aus T-Zellen
extrahiert und analysiert. Sowohl ADAM10 als auch ADAM17 wurden in denselben
Fraktionen nachgewiesen, in denen auch der FasL lokalisiert ist. Sekretorische
Lysosomen könnten folglich ein intrazelluläres Kompartiment darstellen, in welchem
Zusammenfassung
132
Enzyme und Substrat aufeinander treffen. Die TZR/CD3-Stimulation änderte nichts
an der Verteilung, jedoch wurden für ADAM10 und ADAM17 zusätzliche Banden
detektiert.
Die Beteiligung von Raft-assoziierten Src-Kinasen bei dem TZR/CD3/CD28-
induzierten Shedding und vorhergehende Studien zur Lokalisation des FasL auf der
Plasmamembran legten eine mögliche Kolokalisation der ADAM-Proteasen und des
FasL in lipidhaltigen Signalplattformen nahe. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
wurden Detergenz-resistente Membranen isoliert und nachgewiesen, dass ADAM10
und ADAM17 in unstimulierten T-Zellen nahezu komplett von Cholesterol-
angereicherten Raft-Fraktionen ausgeschlossen sind, während geringe Mengen des
FasL nachgewiesen werden konnten. Durch Aktivierung des TZR/CD3-Komplexes
erfolgte eine Änderung der Lokalisation zu Detergenz-resistenten Lipid Rafts von
ADAM10 und ADAM17 und auch eine stärkere Abundanz des FasL wurde
beobachtet. Diese aktivierungsinduzierte Verschiebung lässt sich durch
Cholesteroldepletion und Inhibition von Src-Kinasen aufheben, was in einer
verminderten FasL-Proteolyse resultierte. Zusätzlich wurde durch Verwendung eines
Palmitoylierungsinhibitors gezeigt, dass Palmitoylierung als posttranslationale
Modifikation für die TZR/CD3-induzierte Prozessierung des FasL von wesentlicher
Bedeutung ist.
Da ADAM10 in der zytoplasmatischen Domäne zwei Prolin-reiche Bindungsmotive
zur potentiellen Interaktion mit SH3-Domänen aufweist, wurden ergänzend zu
eigenen Vorarbeiten mögliche Interaktionspartner von ADAM10 über die
Verwendung einer Phagenbibliothek mit allen 305 humanen SH3-Domänen
identifiziert. 38 potentiell interagierende SH3-Domänen konnten in Präzipitaten der
intrazellulären Domäne von ADAM10 identifiziert werden. Eine Interaktion von
Endophilin-A2, Src-verwandte Tyrosinkinasen (Abl, Fyn, Hck, Lck, Src, Yes), Grb2-
ähnlichen Adapterproteinen (Grb2, GRAP, GRAP2), PACSINen (PACSIN1-3) und
SNXen (SNX9, SNX18, SNX33) konnte durch Pull-Down-Analysen und/oder Ko-
Immunpräzipitationen nachgewiesen werden.
Summary
133
8. Summary
As a member of the TNF superfamily, the Fas-Ligand can induce apoptosis by
binding to its receptor on Fas-positive cells. Therefore, the expression of the FasL
has to be strictly regulated at any time. As a posttranslational modification,
proteolysis by the metalloprotease ADAM10 was shown to control FasL expression.
Stimulation with phorbol ester (TPA) and calcium ionophore (Ionomycin) is often used
in order to induce proteolytic processing of FasL. It could be shown that only the
combination of both stimuli results in a mild decline of membrane bound ADAM10
and a high increase of FasL proteolysis. Downregulation of either ADAM10 or
ADAM17 proved that ADAM10 is indeed the main responsible sheddase of the FasL
during TPA/Ionomycin-induced proteolysis.
Providing a more physiological stimulus of T cells by activating the TCR/CD3
complex and CD28 as a co-stimulatory signal, the influence on proteolytic cleavage
of FasL was analyzed. TCR/CD3/CD28-induced activation resulted in increased
production of soluble FasL and NTFs, comparable to TPA/Ionomycin-induced
shedding. This effect can be blocked by using the Src kinase inhibitor PP1. Transient
transfection with specific siRNAs against ADAM10 and/or ADAM17 revealed an
influence of both ADAM10 and ADAM17 in TCR/CD3/CD28-induced proteolysis.
Inducible surface expression of ADAM17 after TPA/Ionomycin treatment, which can
be blocked by inhibitors of actin filament formation, suggesting a storage of ADAM17
in vesicular compartments. In order to address an intracellular exposition of FasL with
the two proteases, secretory granules were isolated from T cells. Both ADAM10 and
ADAM17 were detected in the same organelle fractions, where also FasL as a
marker for secretory lysosomes was present. Activation of the TCR/CD3 complex did
not alter the distribution of ADAMs and FasL. Secretory lysosomes might therefore
reveal a putative intracellular storage compartment for enzymes and substrate.
Furthermore, localization of ADAM10/ADAM17 and FasL in cholesterol-enriched
microdomains was analyzed. In unstimulated T cells, both proteases were more or
less excluded from light raft fractions, whereas low amounts of FasL could also be
detected in lipid rafts. Activation of the TCR/CD3 complex resulted in increased
recruitment of ADAM10, ADAM17 and FasL to light fractions. This activation-induced
shift was prevented by inhibiting Src kinases or depletion of cholesterol., also leading
Summary
134
to reduced levels of sFasL and NTF formation. In addition, also the inhibition of
palmitoylation as a posttranslational modification was shown to reduce shedding
activity.
ADAM10 contains two proline-rich regions for SH3 domain-binding within the
cytoplasmic tail. In order to screen for interacting proteins, a phage display library
containing all human 305 SH3 domains was used. 38 putative interacting SH3
domains were identified from precipitates with the cytoplasmic portion of ADAM10.
Interactions were confirmed for Endophilin-A2, Src-related tyrosine kinases (Abl, Fyn,
Hck, Lck, Src, Yes), Grb2-related adapter proteins (Grb2, GRAP, GRAP2), PACSINs
(PACSIN1-3) and SNXs (SNX9, SNX18, SNX33) by pull down and/or co-
immunoprecipitations.
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Anhang
152
10. Anhang
10.1 Publikationsliste
Originalarbeiten
Ebsen H, Schröder A, Kabelitz D, Janssen O.
Differential surface expression of ADAM10 and ADAM17 on human T lymphocytes and tumor cells.
PLoS One. 2013 Oct 9;8(10):e76853.
Lettau M, Voss M, Ebsen H, Kabelitz D, Janssen O.
Differential protein-protein interactions of full length human FasL and FasL fragments generated by proteolysis.
Exp Cell Res. 2014 Jan 15;320(2):290-301.
Ebsen H, Lettau M, Kabelitz D, Janssen O.
Identification of SH3 domain proteins interacting with the cytoplasmic tail of the a disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10).
PLoS One, Juli 2014, im Druck
Ebsen H, Lettau M, Kabelitz D, Janssen O.
Subcellular localization and activation of ADAM10-dependent FasL shedding in T lymphocytes.
eingereicht
Veröffentlichte Tagungsbeiträge
Oberdoerster H, Lettau M, Gelhaus C, Janssen O.
Identification of interaction partners for ADAM10.
14th Joint Meeting of the Signal Transduction Society (abstract)
Oberdoerster H, Schröder A, Janssen O.
Expression, Localisation and Interaction Partners of ADAM10.
IRTG Symposium CRC877 Proteases and Pathophysiology (abstract)
Oberdoerster H, Schröder A, Janssen O.
Expression, Localisation and Interaction Partners of ADAM10.
Joint Annual Meeting SIICA/DGFI 2011 (abstract)
Oberdoerster H, Schröder A, Janssen O.
Expression, Localisation and Interaction Partners of ADAM10.
15th Joint Meeting of the Signal Transduction Society 2011 (abstract)
Anhang
153
Oberdoerster H, Schönbeck B, Janssen O.
Controlling the death factor CD95L: role of the proteases ADAM10 and SPPL2a.
16th Joint Meeting of the Signal Transduction Society 2012 (abstract)
Ebsen H, Scherer G, Janssen O.
Activation-induced changes in the localisation and shedding process of CD95L and ADAM10.
17th Joint Meeting of the Signal Transduction Society 2013 (abstract)
Ebsen H, Lettau M, Kabelitz D. Janssen O.
Localization and activation requirements for ADAM10-mediated FasL shedding in human T cells.
44th Annual Meeting of the German Society for Immunology (abstract)
Vorträge
3rd Autumn School „Current Concepts in Immunology“
Proteolysis-dependent post-translational modifications in control of the death factor CD95L.
Oct. 9-14, 2011; Bad Schandau, Deutschland
Preise
2nd Poster prize
Controlling the death factor CD95L: role of the proteases ADAM10 and SPPL2a.
17th Joint Meeting of the Signal Transduction Society 2012
Anhang
154
10.2 Tabelle A1 GST/GST-hADAM10(697-748)- und GST-interagierende SH3-Domänen. Modifiziert nach Ebsen et al., 2014
1Anzahl sequenzierter Klone, präzipitiert mit GST-hADAM10(697-748) oder GST
SH3-Domäne (Genname)
Uniprot-Nr. hADAM10(697-748)
(n=216)1 GST
(n=75)1
ARHG9 O43307 72 27
IASPP Q8WUF5 21 5
NOXO1 Q8NFA2 10 2
Eps8R1 Q8TE68 7 1
ZO1 Q07157 6 2
SH3TC2 Q8TF17 4 3
SH3BP4 Q9P0V3 4 2
NCF1 P14598 4 1
SKAP1/55R Q86WV1 4 1
MYO15A Q9UKN7 3 1
DLG5 Q8TDM6 3 1
SH3RF3 Q8TEJ3 3 1
SH3PXD2B A1X283 2 2
SHANK1 Q9Y566 2 1
CACNB4 O00305 2 1
ARHGAP4 P98171 2 1
Eps8R3 Q8TE67 1 3
CACB3 P54284 1 2
MYO7B Q6PIF6 1 1
ASPP2 Q13625 1 1
SHANK2 Q9UPX8 1 1
MYO15B Q96JP2 1 1
MACC1 Q6ZN28 1 1
DOCK3 Q8IZD9 1 1
NOXA1 Q86UR1 - 2
MPP2 Q14168 - 2
FCSD1 Q86WN1 - 1
NPHP1 O15259 - 1
SKAP2 O75563 - 1
CSKI1 Q8WXD9 - 1
DLG3 Q92796 - 1
TXK P42681 - 1
DNMBP Q6XZF7 - 1
MATK P42679 - 1
Anhang
155
10.3 Abbildungen A1-3
Abbildung A1: Coomassie-Färbung der genutzten Fusionsproteine der Pull-Down-Analysen. Vor der Präzipitation aus Zelllysaten wurden die verwendeten Fusionsproteine getestet. Je 25 µg wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Färbelösung sichtbar gemacht.
Abbildung A2: Coomassie-Färbung der genutzten Fusionsproteine der Pull-Down-Analysen. Vor der Präzipitation aus Zelllysaten wurden die verwendeten Fusionsproteine getestet. Je 25 µg wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Färbelösung sichtbar gemacht.
Anhang
156
Abbildung A3: Coomassie-Färbung der genutzten Fusionsproteine der Pull-Down-Analysen. Vor der Präzipitation aus Zelllysaten wurden die verwendeten Fusionsproteine getestet. Je 25 µg wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Färbelösung sichtbar gemacht.
Anhang
157
10.4 Danksagung
Besonderer Dank gebührt meinem Betreuer Prof. Dr. rer. biol. hum. Ottmar Janßen für die Bereitstellung des interessanten Themas. Seine Unterstützung bei meiner wissenschaftlichen Arbeit und das entgegengebrachte Vertrauen förderten das Gelingen dieser Arbeit und trugen zum Voranschreiten des Projektes bei. Auch die Möglichkeit, eigene Daten auf verschiedenen Tagungen zu präsentieren und zu diskutieren, half bei der Weiterführung der Arbeit.
Für die Übernahme der Betreuung und des Referates meiner Arbeit vor der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas Bosch herzlich bedanken.
Dank gilt ebenfalls dem Direktor des Institutes für Immunologie Prof. Dr. med. Dieter Kabelitz für die Möglichkeit, diese Arbeit anzufertigen. Auch den Mitarbeitern am Institut für Immunologie danke ich für die freundschaftliche Atmosphäre und Hilfestellungen während der letzten Jahre.
Mein besonderer Dank gilt Alyn Gerneth und Gudrun Scherer, die exzellente technische Unterstützung leisteten. Immer hilfsbereit und motiviert unterstützten sie mich im Rahmen dieser Arbeit in technischen Dingen. Auch Melanie Nebendahl, Signe Valentin, Benjamin Schönbeck und Marcus Lettau standen mir stets unterstützend zur Seite. Für die insgesamt angenehme und herzliche Zusammenarbeit möchte ich jetzigen und ehemaligen Kollegen der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ottmar Janßen besonders danken.
Weiterer Dank gilt Susann Voigt und Guranda Chitadze für die Unterstützung im Rahmen dieser Arbeit und für ihre Freundschaft.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie, meinem Mann Gerrit, meinen Eltern Urte und Thomas, meiner Schwester Anne sowie meiner Großmutter Ingeborg für ihre immerwährende Unterstützung, Aufmunterung, Liebe und ihr Interesse an meiner Arbeit.
Vielen Dank.
Anhang
158
10.5 Wissenschaftlicher Werdegang
Zur Person:
Name: Henriette Ebsen, geb. Oberdoerster
Wohnort: Kanalufer 212 in 24768 Rendsburg
Geburtsdatum: 13. Juli 1986
Geburtsort: Berlin
Staatsangehörigkeit: deutsch
Promotion:
seit 09.2010 Promotionsarbeit zum Thema „Lokalisation und Aktivierung von ADAM-Proteasen im Kontext der Fas-Ligand-Proteolyse in T-Zellen“ im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 877 („Proteolysis as a regulatory event in pathophysiology“) in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ottmar Janßen, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel (CAU)
Hochschulstudium:
01.2010 - 08.2010 Diplomarbeit zum Thema „Identifizierung von Interaktionspartnern von ADAM10“ in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ottmar Janßen, CAU
10.2005 - 08.2010 Diplomstudium der Biologie an der CAU
Abschluss: Diplom
Schulbildung:
08.1998 - 07.2005 Archenhold Oberschule in Berlin
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Anhang
159
10.6 Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides statt gemäß § 8 der Promotionsordnung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vom 31. August 2012, dass ich die vorliegende Arbeit unter der wissenschaftlichen Leitung von Prof. Dr. Ottmar Janssen selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe. Die Abhandlung ist nach Form und Inhalt, abgesehen von der Beratung durch Prof. Janssen, die eigene Arbeit. Weiterhin habe ich keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und die den verwendeten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht. Die vorliegende Arbeit entstand unter Einhaltung der Regeln guter wissenschaftlicher Praxis der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Auszüge der Dissertation wurden bereits in Fachzeitschriften veröffentlicht bzw. eingereicht.
Ich versichere, dass ich weder an der Universität Kiel noch anderweitig versucht habe, eine Dissertation einzureichen oder mich einer Promotionsprüfung zu unterziehen.
Kiel,
Henriette Ebsen