Post on 05-Apr-2015
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Lipide
Grundlagen• Was sind Lipide?
• Arten und Funktionen von Lipiden• Glycerophospholipide• Mono-, Di- und Triglycerine• Ergosteriol und Ergosterylester• Freie Fettsäuren• Sphingolipide
• Isolierung• Auftrennung• Wieso 2D DC?• Nachweis
Arbeiten mit radioaktiven Substanzen• Eigener Bereich für radioaktives Arbeiten• Art der Strahler • Umgang mit radioaktiven Substanzen• Substanzen gesondert entsorgen• Nach abgeschloßener Arbeit: Dekontamination des
Arbeitsplatzes
Durchführung
Vorbereitung der Hefekultur
Zellkonzentration mittels OD bestimmen
Zellen in Minimalmedium
vorinkubieren
Zugabe von 1-14C-Palmitinsäure
Lösung inkubieren
BSA-Lösungzugeben
Zellpellet waschen
Zellen
aufschließen
Lipide extrahieren
Mittels DC auftrennen
Aktivität der Fraktionen bestimmen
Durchführung des Aktivitätsassays
Vorbereitung des Reaktionsansatzes
Zuagen von Stopplösung nach 0, 10, 20 Minuten
Bestimmen der Aktivität
ZählausbeuteProbe Cocktail cpmLE cpmBW dpmLE dpmBW cpm*/dpm* %Zählausbeute
6 Safety Cocktail MW Probe 6 MW Probe 9 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe6-Probe9)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100
7 Safety Cocktail + H2O MW Probe 7 MW Probe 10 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe7-Probe10)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100
8 Safety Cocktail + H2O + Kieselgel MW Probe 8 MW Probe 11 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe8-Probe11)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100
Berechnungen
Spezifische Aktivität der Palmitinsäure
GBq/mmol dpm/mmol cpm/mmol
2,1 2,1*60 *10^9 dpm*Zählausbeute
Theoretische Totalaktivität
MBq/100ml fV dpm/10ml
37 10 37*60/fV*10^6
Bilanz
Probe Messvolumen µl cpm/Messung cpm*/Messung Gesamtvolumen ml Gesamtaktivität dpm
Totalaktivität 100 MWProbe 1 Probe1-Probe6 10,1 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Medium 100 MWProbe2 Probe2-Probe6 11 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Waschwasser1 100 MWProbe 3 Probe3-Probe6 5 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Waschwasser2 100 MWProbe 4 Probe4-Probe6 10 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Zellen 100 MWProbe 5 Probe5-Probe6 10 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Aufnahmerate
theorethische Konzentration 37000*60*1000/10,1/132000000 µmol/l
tatsächliche Konzentration cpm*Totalaktivität/Zählausbeute*10000/132000000 µmol/l
Zellkonzentration 1 mg/ml
Inkubationszeit 10 min
Einbau GesamtaktivitätZellen/GesamtaktivitätTotalaktivität*100 %
Aufnahmerate GesamtaktivitätZellen/100*Zählausbeute cpm*/(mg*min)
GesamtaktivitätZellen/100 dpm*/(mg*min)
GesamtaktivitätZellen/100/1,32*10^8 nmol/(mg*min)
Gesamtlipide
cpm cpm* % AktivitätLSC % Gesamtaktivität
Phospholipide MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Diacylglycerine MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
freie Fettsäuren MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Triacylglycerine MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Sterolester MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Summe Summe MW Summe MW-BW Summe=100% Summe MW-BW/MW-BW
Gemessene Gesamtaktivität MW MW-BW
Phospholipide
cpm cpm* % Aktivität 1.Dim % Aktivität 2.Dim % Gesamtaktivität
PC 2421 2345 42,6 30,8 28,8
PS 481 405 7,4 5,3 5,0
PI 1958 1882 34,2 24,8 23,1
PE 826 750 13,6 9,9 9,2
DMPE 57 0 0,0 0,0 0,0
PA 439 363 6,6 4,8 4,5
LP 152 76 1,4 1,0 0,9
CL 25 0 0,0 0,0 0,0
FS 536 460 8,3 6,1 5,6
JVL 1398 1322 24,0 17,4 16,2
Summe 8293 7603 138,0 100,0 93,4
Gemessene Gesamtaktivität 8219 8143
0 10 200
0.5
1
1.5
2
2.5
f(x) = 0.100118243243243 x − 0.0562049549549546R² = 0.986391545948243
Aktivitätsassay
Zeit [min]
Men
ge [n
mol
*f]
Anfangsgeschwindigkeitzeit dpm mmol nmol nmol*f zeit dpm mmol nmol nmol*f
0 173 2,64E-11 2,64E-05 0,01 0 MW MW/6,55E+12 mmol *E+6 nmol*442,2510 11976 1,83E-09 0,00183 0,81 10 MW MW/6,55E+13 mmol *E+6 nmol*442,2520 29808 4,55E-09 0,00455 2,01 20 MW MW/6,55E+14 mmol *E+6 nmol*442,25
Serin konz.Ci/ml Ci/mmol Bq/mmol dpm/mmol
0,001 29,5 1,0915E+11 6,549E+12 1Ci 3,7E+10Bq
Diskussion
Phospholipide Diacylglycerine freie Fettsäuren Triacylglycerine Sterolester Sterole0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Gesamtlipide
Wildtyp Mutante psd1psd2 Vergleich WildtypVergleich Mutante
% d
er G
esam
takti
vitä
t des
Coc
ktai
ls
PC PS PI PE DMPE PA LP0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
Phospholipide
Wildtyp Mutante psd1psd2 Vergleich Wildtyp
% d
er G
esam
takti
vitä
t des
Coc
ktai
ls
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
PS : PE
Wildtyp
Mutante psd1psd2
Vergleich Wildtyp
Vergleich Mutante
Aktivitätsassay
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
f(x) = 0.197280405405405 x + 0.194695945945947R² = 0.981465973602446
f(x) = 0.100118243243243 x − 0.0562049549549546R² = 0.986391545948243
Wildtyp
Zeit [min]
Konz
entr
ation
[nm
ol]