In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten P D-R P D-R P D-R P D-R P...

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In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten

PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-R

D-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RP

3´D-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-R PD-RPD-RPD-RPD-RPD-RPD-R PD-RP

Das Rückgrat jeder Kette ist der Phosphate (P)-----Desoxyribose (D-R) -Strang

Die Basen sind wie Rippen an diesem Rückgrat angeordnet, und jeweils an dieDesoxyribosen gebunden

Die beiden Stränge sind antiparallel angeordnet

5´ 3´3´ 5´

Die beiden Stränge treten entlangen der Basenzusammen und werden zusammengehaltendurch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen(ii) hydrophobe WechselwirkungenA und T bilden ein Basenpaar mit 2 H-BrückenG und C bilden ein Basenpaar mit 3 H-Brücken

Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen

Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen

0.27-0.31 nm

12 - 29 kJ/mol

biologisch releveant

Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarungdie beiden DNA-Stränge treten entlang der Basen zusammen und werden zusammen-gehalten durch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen

die Basen auf den gegenüberliegenden Strängen stehen sich exakt gegenüber

A und T ein Basenpaar mit 2 H-Brücken G und C ein Basenpaar mit 3 H-Brücken

die Basen sind planar gebaut > Stapelung der Basenpaare in der Doppelhelix (´base stacking´)

3´ 5´

H-Brücken

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

G = C A+G = T+CA = T

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Bei der doppelsträngigen DNA einer Zelle ist der Anteil an dGMP etwas 20 %.

Etwa wie hoch ist der Anteil an dAMP (nach der Chargaff-Regel)?

(A) 20 %

(B) 30 %

(C) 40 %

(D) 60 %

(E) 80 %

Strukturprinzip der Doppelhelix

das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat bildet eineHelix-Struktur aus

die Basen sind zum Innern der Helix gekehrt und die Desoxyribose/Phosphat-Reste liegen an der Außenseite

die Ringebenen der Basen stehen senkrecht zur Helixachse

die Zucker stehen fast im rechten Winkel zur Base

die genetische Information liegt in der Abfolge der Basenpaare TAGCGT

Leiter-Modell Ribbon-Modell

Raumfüllendes Kalottenmodell

1. Strang (5´)

2. Strang (3´)

große Furche

kleine Furche

rote Linien verbinden die Phosphat-Reste

DNA-bindende Proteine können spezifischan die DNA binden. Dabei lagern sich die Proteinein die große bzw. kleine Furche ein und bekommendadurch Zugang zu den Basen. Dadurch ist die Erkennung einer spezifischen Basenabfolge möglich (z. B. Transkriptionsfaktoren, Restriktionsenzyme)

Rechtsläufige Doppelhelix Entspricht 99% der zellulären

GCGCGCGC Abfolge

Zick-Zack Verlauf des Phosphodiester-Bandes

Linksläufige DoppelhelixEntsteht bei drastischer Abnahmedes Wassergehalts

Rechtsläufige Doppelhelix

Basenpaare nicht senkrecht wie bei B-Form, sondern um 70° gekippt

Offener Raum im Molekülinneren

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Zusammenfassung der DNA Struktur

1953 haben Watson & Crick die drei-dimensionale Struktur der DNA -Doppelhelix aufgeklärt und sofort den Mechanismus derDNA-Replikation vorhergesagt

wichtig ist, daß die genetische Information (= Abfolge der Basensequenz in der DNA-Kette) während der Zellteilung exakt von der Mutterzelle auf die Tochterzelle übertragen wird

bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze

Fehler können sich kastastrophal auf die Lebensfähigkeit der Zelle auswirken, oder Krebs entstehen lassen

bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze

AT CG AT

TGA TGCC

AAAT CG ATTC A TT

Met Gln Asp Ser StopSinnstrang

G A TA

A TT 5'

Met Gln Asp Ser Stop

AT GATG

A TT3'

Fehler bei der VerdopplungT statt C

Mutterzelle

Tochterzelle

1. Replikation der DNA

G A TA

A TT 5'

AT GA TG

A TT3'

Fehler bei der VerdopplungT statt C

Mutterzelle

Tochterzelle

G A TA

GATG C

A TT 5'

AT GATG

A TT3'

Replikation der DNA derTochterzelle Sinnstrang

Manifestation der Mutation (T::A) ineinem der beiden Stränge der 2.

Generation

AT CG AT

GA TGCC

AAAT CG ATTC A TT

Elternstrang 1Elternstrang 2

Reißverschlußartige Trennung der beiden Elternsträngeentlang der Basenpaare

= Brechen der H-BrückenAT

G A TA

A TT 5'

AT GATG

A TT3'

Elternstrang 1

Elternstrang 2

Tochterstrang 2

Tochterstrang 1

IdentischeVerdopplung

Parentale DNA-Doppelhelix

DNA-Molekülenach einerRunde der

Replikation

KonservativeReplikation

Semi-KonservativeReplikation

A1 A2 N1 N2 A1 A2 N2N1

Semi-konservative DNA-Verdopplung

wurde durch Watson & Crick (1953) vorhergesagt,aber erst durch ein klassisches Experiment (1959) bewiesen von

Meselson & Stahl

Der semi-konservative Replikationsmechanismus wurde zunächst für E. coli gezeigt, und später für alle Organismen einschließlich Homo sapiens bewiesen

Verfüttern von 15N-StickstoffNährmedium an E. coli

DNA enthält normalen = leichten 14N-Stickstoff

E. coli

„Leichte DNA“

DNA enthält jetzt ausschließlichschweren 15N-Stickstoff

„Schwere DNA“

Anschließende Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid

durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation

Rückführung der Bakterien in 14N-Stickstoff-Nährmedium

für eine Verdopplungszeit von 20 min

1. Verdopplungmit 14N-Stickstoff

(leicht = L)

2. Verdopplungmit 14N-Stickstoff

(leicht = L) Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid

durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation

S-S S-S

S-S S- LS- LL-L

S-S S- LS- LL-L L-L L-L L-LL-L

Semi-konservativkonservativ

Mögliche Ergebnisse Experimentelle Befunde(Meselson & Stahl, 1958)

Wachstum in 15N-MediumSchwere DNA(schwer = S)

L-L S-L

Das Beweis-Experiment, daß auch eukaryontische DNA semi-konservativ repliziert wird

Dazu wurden Wurzelzellen mit [3H]-Thymidin (radioaktiver Wasserstoff!)durchmarkiert, isoliert und anschließend autoradiographisch untersucht

Radioaktiv-markiert Probe (z. B. [3H]-Thymidin-markiertes Chromosom)

beim -Zerfall des Tritiums werden Elektronen frei, die den Röntgenfilm an den Stellen schwärzen (Ag-Körner), an denendie Chromosomen auf dem Film aufliegen.

Genauigkeit der Lokalisierung: ca. 0.5 - 1.0 m

Objektträger

Röntgen-Film mit AgBr-Emulsion

…….semi-konservative Replikation von eukaryontischer DNA in Wurzelzellen

A1 A2A1 N1A2 N2

Teilung DNA-Replikationin nicht-radioaktivemMedium

DNA-Synthese inradioaktivem Medium [3H]-Thymidin

2n 1n2n

beide Schwester-Chromatide

sind markiert

Autoradiographie-Bild

nur ein Schwester-Chromatid

ist markiert

Autoradiographie-Bild

Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional

• Die Replikation der DNA erfolgt nicht spontan, sondern wird durch Enzyme (DNA-Polymerasen) katalysiert

• Grundsätzlich gilt, daß die DNA-Polymerasen die Replikation nicht an jeder beliebigen Stelle der DNA initiieren, sondern nur am Replikations-Startpunkt = “Origin“

Replikationsgabel

• am häufigsten findet man, daß die Replikation am Origin beginnt und sich von dort bi-direktional forstsetzt

• dadurch entstehen 2 Replikationsgabeln

• bei ringförmiger DNA (z. B. E. coli) genügt meist ein Origin. Die beiden dort entstehenden Replikationsgabeln verschmelzen schließlich auf der gegenüberliegendenen Seite des Origins nach erfolgter Replikation

Ende der Replikation

Wachstum in beide Richtungenrechte Wachstumsgabellinke Wachstumsgabel

• die langen, linearen eukaryontischen Chromosomen (= lineare DNA) haben viele DNA-Replikations-Startpunkte (vermutlich einige tausende bis zehntausende Origins beim Menschen)

• die bi-direktionalen Replikationsgabeln bewegen sich aufeinander zu, solange bis sich benachbarte Startpunkte begegnen

• durch das Vorhandensein von vielen Replikons (Replikations-Startstellen) schafft es die eukaryontische Zelle die ca. 1000-fach größere DNA (vgl. E. coli > Mensch) in der erforderlichen Zeit zu replizieren

• Der Nachweis der bi-direktionalen DNA-Replikation wurde durch Autoradiographie von radioaktiv markierter DNA, die aus Säugerzellen isoliert wurde, erbracht.

• Markierung der DNA erfolgte mit [3H]-Thymidin, zunächst von niedriger Radioaktivität.Nach Beginn der Replikation wurde die Menge an radioaktivem [3H]-Thymidin erhöht. Anschließend wurden die Chromsomen autoradiographiert.

Autoradiogramm

hohe niedrige hohe Radioaktivität

Ori 1 Ori 2

[3H]-markierte DNA

• Elektronenmikroskopische Aufnahmen von sich replizierender DNA aus Drosophila-Zellen, die sich rasch teilen (= aktive DNA-Replikation). Die Pfeile zeigen Replikationsblasen, in denen bi-direktionale Replikation stattfindet.

1n DNA

Replikationsblase

2n DNA

Replikationsgabel

Sichtbarmachen von Replikationsblasen

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Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln

hohe niedrige hohe Radioaktivität

Länge der radioaktiv markierten DNA (m) in Abhängigkeit der Replikationsdauer

OriC t1

• Zellen werden unterschiedlich lang mit [3H]-Thymidin markiert, bevor die DNA isoliert und autoradiographisch analysiert wird

• durch die Länge der Schwärzung auf dem Röntgenfilm kann die Geschwindigkeit, mit der sich die Replikationsgabel entlang der DNA bewegt, bestimmt werden

Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln

Länge der DNA auf dem Autoradiogramm proportional zur Anzahl der replizierten Basenpaare> Bestimmung der Replikationsgeschwindigkeit = 1000 BP/sec/Gabel bei E.coli

Kleine Rechnungbei E. coli dauert die Replikation 20 min (Genomgröße = 3 x 106 BP)

bei 2 Replikationsgabeln mit einer V = 1000 BP/secstimmen theoretischer und errechneter Wert überein1200 sec x 1000 BP = 1.2 x 106 BP

bei 2 Gabeln: 2.4 x 106 BP

Homo sapiens ~ 100 BP/sec/Gabel(Autoradiographie)

bei 3 x 109 BP/Genom benötigt man ca. 1000 Replikationsgabeln für dieReplikation des gesamten Genoms (in ca.10 hr)

Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E.

DnaA(ATPase)

Erkennung

Startkomplex

OffenerKomplex

30°CDnaB = HelikaseDnaCATP

„Prä-Priming“Komplex

- Primase- DNA-PolymeraseReplikation

leichtes „Schmelzen“ der

In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten P D-R P D-R P D-R P D-R P...

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