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Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe Jahrgang: ...2008/2010
Memmingen Leistungskurs:...................Biologie
Kollegiatin: .......Anja Rießenberger
Facharbeit
GFP - Klonierung in E.coli
Abgegeben am __________
Bewertung:
Facharbeit: Note: ________ Punkte: ________
Mündliche Prüfung: Note: ________ Punkte: ________
Gesamtergebnis: Note: ________ Punkte: ________
Datum und Unterschrift des Kursleiters: _____________________________________
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Gliederung
1. Einleitung ..................................................................................................................... 3
2. Allgemeines.................................................................................................................... 3
2.1 GFP ..................................................................................................................... 3
2.2 E.coli ..................................................................................................................... 4
3. Wie kommt die Qualle ins Bakterium? – Methoden und Materialien................................ 4
3.1 Agar-Ampicillin-Platten............................................................................................ 4
3.1.1 Materialien.................................................................................................... 4
3.1.2 Herstellung ................................................................................................... 5
3.2 Ausstreichen der Agarplatten.................................................................................. 5
3.3 Anlegen einer Übernachtkultur................................................................................ 6
3.4 Plasmidpräparation................................................................................................. 7
3.4.1 Materialien.................................................................................................... 7
3.4.2 Durchführung................................................................................................ 8
3.5 Gelelektrophorese .................................................................................................. 9
3.5.1 Materialien.................................................................................................... 9
3.5.2 Durchführung.............................................................................................. 10
3.6 Restriktionsverdau ................................................................................................ 11
3.6.1 Restriktionsenzyme .................................................................................... 11
3.6.2 Durchführung.............................................................................................. 12
3.6.3 Analyse durch Gelelektrophorese............................................................... 12
4. Ausblick ................................................................................................................... 13
5. Quellenverzeichnis ....................................................................................................... 15
6. Schülererklärung .......................................................................................................... 17
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1. Einleitung
“The wonderful future that fluorescent proteins will bring us cannot be imagined at this
point“(gfp.conncoll.edu, 2009).
Meine Aufgabe für diese Facharbeit bestand darin, Bakterien zum Leuchten zu bringen, was
dadurch erreicht wird, dass ein grün fluoreszierendes Protein in ein E.coli Bakterium
transformiert wird.
2. Allgemeines
Im Folgenden eine kurze Beschreibung der Protagonisten dieser Facharbeit:
2.1 GFP
Green Fluorescent Protein taucht ausschließlich in einer bestimmten Quallenart auf – der
Aequorea victoria. Für die Wichtigkeit der „Entdeckung und Entwicklung des grün
fluoreszierenden Proteins, GFP“ wurden 2008 Osamu Shimomura, Marty Chalfie und Roger
Tsien mit dem Nobelpreis in der Chemie ausgezeichnet.
M. ZIMMER (gfp.conncoll.edu, 2009) misst GFP sogar eine derart hohe Bedeutung in der
Molekularbiologie bei, dass er es als „Mikroskop des 21. Jahrhunderts“ bezeichnet hat .
Abb. 1: Aquorea victoria (gfp.conncoll.edu, 2009)
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2.2 E.coli
„Das in der menschlichen Darmflora vorkommende Escherichia coli ist das ‚Haustier‘ der
Molekularbiologen. Lange Zeit war E.coli molekularbiologisch und genetisch der am besten
untersuchte Organismus. Das Genom ist vollständig sequenziert und die meisten der 4288 Gene sind
in ihrer Funktion charakterisiert. […]
Genetisch veränderte E.coli - Stämme werden eingesetzt, um bestimmte Proteine […] zu produzieren.
E.coli dient aber auch im Labor als Vermehrungssystem, etwa um bestimmte Gen-Sequenzen oder
Vektoren zu ‚klonieren‘“ (www.biosicherheit.de, 2009).
Letzteres spielt im Folgenden eine tragende Rolle.
Abb. 2: E.coli (microvet.arizona.edu, 2010)
3. Wie kommt die Qualle ins Bakterium - Methoden und Materialien
Um die E.col i- Bakterien später unter ultraviolettem Licht leuchten lassen zu können, sind
meherer Arbeitsschritte nötig:
3.1 Agar-Ampicillin-Platten
Wie sie hergestellt werden und was dafür benötigt wird nun näher erklärt:
3.1.1 Material
• Glasflasche
• 1,31 g Lactose-Agar
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• 65 ml steriles Wasser
• Handschuhe
• 65 µl Ampicillin
• 5 sterile Petrischalen
3.1.2 Herstellung
Der Lactose-Agar wird mit dem sterilen Wasser in der Glasflasche vermengt. Danach wird
die Mischung in der Mikrowelle so lange gekocht, bis eine klare Lösung entsteht.
Anschließend wird dies autoklaviert. (SCHMITT, 2008: S. 14) Dieses Verfahren wird im
Folgenden erläutert:
„Autoklavieren ist eines der wichtigsten Verfahren zur Keimabtötung. Das
Autoklavierverfahren (121°C, 1 bar Wasserdampfüberdruck, 20 min) stellt einen sehr
wichtigen Schritt bei mikrobiologischen und molekularbiologischen Experimenten dar. Mit
diesem Verfahren töten Sie alle lebensfähigen Keime und sogar deren Dauerstadien sicher
ab. Zusätzlich inaktivieren Sie auf diese Weise eine Reihe von Chemikalien wie z.B.
Antibiotika“ (www.nugi-zentrum.de, 2010 a).
Das Medium wird deswegen erst nach dem Autoklavieren mit dem Ampicillin beimpft. Durch
die Ampicillin - Beimpfung wird erreicht, dass unerwünschte Bakterienkulturen sich nicht
entwickeln können, sondern nur die gewollten ampicillinresistenten pHAT-GFPuv Bakterien
wachsen.
Weil Agar oberhalb von 50°C noch flüssig ist, wartet man so lange, bis es auf 60°C
abgekühlt ist, um es dann vorsichtig in die Petrischalen bis zu einer Höhe von 2-3 mm zu
gießen. Damit eine Kontamination vermieden wird, sollten die Platten sofort wieder mit dem
Deckel verschlossen werden. Nun werden die Platten ein bis zwei Tage auf der Laborbank
stehen gelassen, damit überschüssige Feuchtigkeit verdunstet. (SCHMITT, 2008: S. 14)
3.2 Ausstreichen der Agar-Platten
„Diese Technik wird z.B. angewendet für das Anlegen von Stammkulturen. Solche
Stammkulturen auf Agaroberflächen stehen über Tage, Wochen oder einige Monate für
Experimente zur Verfügung. Im Verlauf des Ausstriches kommt es zur Vereinzelung von
Bakterienzellen. Also können auch mit dieser Technik Klone erhalten werden“ (www.nugi-
zentrum.de, 2010 b)
Material:
• Agarplatten
• Bunsenbrenner
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• Platinimpföse
• 80%iger Alkohol zum Desinfizieren
Zu allererst wird die Öse mit dem Bunsenbrenner abgeflammt, um eventuelle sich an der
Öse befindliche Keime und Bakterien abzutöten. Mit der erkalteten Öse wird nun ein Teil
einer pHAT-GFPuv-Kolonie aufgenommen. Nachdem man mit einer Hand den Deckel einer
Agarplatte geöffnet hat, wird dieser mit der Innenfläche nach unten auf die zuvor desinfizierte
Arbeitsplatte gelegt. Nun wird die Öse auf die Agaroberfläche gelegt und ohne Druck oder
Verkanten der Öse über die Agaroberfläche gezogen.
Abb. 3: Ausstrichart auf Agaroberflächen (www.nugi-zentrum.de, 2010 c)
Anschließend wird die Agarplatte wieder mit ihrem Deckel verschlossen und die Öse
nochmals abgeflammt. Um Verwechslungen zu vermeiden und den Überblick zu behalten,
sollten die Agarplatten außen mit Datum und Stamm beschriftet werden. Zuletzt werden
diese Agarplatten bei 37°C mehrere Tage lang bebrütet. (vgl. www.nugi-zentrum.de, 2010 b)
3.3 Anlegen einer Übernachtkultur
Dies ist wohl die einfachste Möglichkeit zur Anzucht von Bakterien. Hierfür beimpft man 3 ml
des Kulturmediums in einem Kulturröhrchen mittels einer sterilen Pipettenspitze mit den zu
züchtenden Bakterien und mit 65µl Ampicillin. Die Pipettenspitze wird kurz in die
Stammkultur von pHAT-GFPuv eingetaucht und anschließend mit Hilfe des Abwerfers in das
Kulturröhrchen eingeworfen. Dabei ist darauf zu achten, dass man mit keinem Teil der
Pipette an den Behälter der Stammkultur und das Röhrchen stößt, um eine Kontamination zu
vermeiden. (SCHMITT, 2008: S. 14) Anschließend wird das Kulturröhrchen in den Schüttler
gestellt und bei 35°C 24 Stunden lang inkubiert. Erfolgreiches Bakterienwachstum kann am
nächsten Tag daran erkannt werden, dass sich das Kulturmedium getrübt hat.
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3.4 Plasmidpräparation
Ein Plasmid ist DNA in Ringform und dient unter anderem dazu, Gene in andere Bakterien
zu übertragen. Plasmid-DNA stellt nur einen Bruchteil der Gesamt-DNA einer Bakterienzelle
dar, was es schwer macht, sie zu erreichen. (www.nugi-zentrum.de, 2010 d)
Abb. 4: Darstellung der Anteile in einer Zelle (www.nugi-zentrum.de, 2010 d)
3.4.1 Materialien
• Pipette und passende sterile Spitzen
• 1,5 ml Übernachtkultur
• Zentrifuge
• Sammelgefäß
• Eppendorf Caps
• 250 µl Puffer P1
• 250 µl Puffer P2
• 350 µl Puffer N3
• Quiagen-Säule und 2 ml Eppendorfgefäß
• 0,5 ml Puffer PB
• 0,75 ml Puffer PE
• 50 µl Puffer TE
Feuchte Zelle
Wasser 80%
Trockenmasse 20%
Trockenmasse
Protein
Membranen undZellwand
RibonukleinsäurenDNA
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3.4.2 Durchführung
Abb. 5: Schematische Übersicht zur Plasmidisolation (www.nugi-zentrum.de, 2010 e)
Zunächst werden 1,5ml der Übernachtkultur in einem Epi für fünf Minuten bei 5000xg
abzentrifugiert. Die Bakterien befinden sich danach am Boden des Epis, sichtbar als weißer
Niederschlag. Der restliche Überstand wird nicht benötigt und deswegen in ein Sammelgefäß
pipettiert. Die übrigen Zellen im Epi werden nun resuspendiert mit dem RNase A haltigen
Puffer P1. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Zellklumpen übrig bleiben dürfen. Bei
diesem Schritt werden die Zellmembranen aufgelöst. Jetzt ist das Plasmid aus der Zelle
freigesetzt und das größere Chromosom bleibt in den Zellen zurück. Anschließend wird der
Puffer P2 hinzugegeben. Diese Lösung wird durch Schwenken über der Längsachse des
Gefäßes vorsichtig gemischt. Der Ansatz wird für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Zugabe des Puffers N3 wird das Epi fünf bis sechs Mal umgedreht, wobei die
Lösung trübe werden kann. Bei maximaler Leistung wird die Lösung nun für zehn Minuten
abzentrifugiert. Diesmal wird jedoch mit dem Überstand weitergearbeitet. Er enthält die
gesuchten Plasmide, der Niederschlag lediglich die Zelltrümmer und wird deswegen
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verworfen. Dieser Überstand wird nun abpipettiert und auf eine Qiagen - Säule gegeben, die
wiederum in das 2 ml Epi gesteckt wird. Hierbei sind dringend Scherkräfte zu vermeiden, da
diese das Plasmid – DNA - Molekül teilweise brechen können. Die Qiagen - Säule im Epi
wird nun bei voller Leistung 30-60 Sekunden lang zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen,
weil die Plasmide auf der Säule hängen bleiben. Daraufhin wird die Säule mit dem Puffer PB
gewaschen, wobei der Puffer auf die Säule gegeben wird und dies wiederum für 30
Sekunden bei voller Leistung zentrifugiert wird. Das Plasmid bleibt weiterhin auf der Säule
hängen, Puffersalze und Proteine jedoch befinden sich im Durchlauf, der wieder verworfen
wird. Anschließend wird der Puffer PE auf die QIAprep - Säule aufgetragen und nochmals
bei voller Leistung 30-60 Sekunden lang zentrifugiert. Der Durchlauf, in dem sich diesmal
Puffersalze und Zellinhaltsstoffe befinden, wird abermals verworfen. Das Plasmid befindet
sich nach wie vor auf der Säule. Um sicher zu gehen, dass wirklich alle Puffersalze aus der
Säule entfernt wurden, wird die Säule nochmals für 60 Sekunden bei voller Leistung
zentrifugiert. Schließlich wird die Säule in ein frisches, steriles Epi gesteckt und der Puffer TE
darauf gegeben. Dadurch wird die Salzkonzentration auf der Säule erniedrigt und das
Plasmid eluiert [=herausgelöst, ausgespült]. Danach wird der Ansatz für eine Minute bei
Raumtemperatur inkubiert und im Folgenden für eine Minute bei voller Leistung zentrifugiert.
Diesmal enthält der Durchlauf die Plasmid-DNA. Abschließend werden 2 µl der
Plasmidlösung in einer Agarosegelelektrophorese analysiert, um festzustellen, ob und
wieviel Plasmid isoliert wurde. (vgl. www.nugi-zentrum.de, 2010 e)
3.5 Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese wird im Labor bevorzugt dafür verwendet, um schnell nachzuweisen,
ob eine Plasmidisolation oder ein Restriktionsverdau erfolgreich waren.
3.5.1 Materialien
• 0,2 g Agarose
• TAE-Puffer (1 fach)
• Schraubdeckelflasche
• Mikrowelle
• Handschuhe
• Agarosegelkammer
• Kunststoffkamm
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• Pipette mit dazugehörigen sterilen Spitzen
• sterile Eppis
• 3 µl Plasmidlösung
• 1 µl Gelladungspuffer
• Zentrifuge
• zweimal 5 µl Größenmarker 100 bp Plus
• Spannungsquelle
3.5.2 Durchführung
Um ein 1% iges Agarosegel zu erhalten, werden 20 ml des TAE-Puffers mit der Agarose in
einer Schraubdeckelflasche vermengt. Anschließend wird dies (ohne Deckel) in der
Mikrowelle solange erhitzt, bis keine Klümpchen mehr sichtbar sind. Beim Herausnehmen
der nun heißen Schraubdeckelflasche empfiehlt es sich, Handschuhe zu tragen, um die
Hand vor Verbrennungen zu schützen. Sobald die Schraubdeckelflasche auf einem
schmelzfesten Untergrund zum Abkühlen gestellt worden ist, sofort den Deckel darauf
schrauben, um zu vermeiden, dass zu viel der Gellösung verdunstet. Wenn die Flasche so
weit abgekühlt ist, dass sie angenehm in die Hand genommen werden kann, wird das Gel
vorsichtig in die Agarosegelkammer gegossen, so dass keine Löcher entstehen.
Darauf folgend wird der Kunststoffkamm an dem Ende eingesetzt, an welchem der Minuspol
der Spannungsquelle angeschlossen werden soll. Nachdem das Gel komplett abgekühlt ist,
wird der Kamm vorsichtig herausgezogen und die Gelkammer so weit mit TAE-Puffer
angefüllt, bis das ganze Gel und die entstandenen Probentaschen damit bedeckt sind.
Nun werden die Plasmidlösung mit 38,5 µg/ml DNA-Konzentration und der Gelladungspuffer
„Loading Dye“ in ein steriles Epi pippetiert. Damit ein homogenes Gemisch entsteht, wird
dies kurz mit Gegengewicht von 4 µl Wasser in die Zentrifuge gegeben.
In die beiden äußersten Probentaschen werden je 5 µl Größenmarker pipettiert. Dies dient
dazu, um einen „Maßstab [zu haben], anhand dessen man beurteilen kann, welche Größe
die nachgewiesenen [DNA-] Fragmente haben.“(SCHMITT, 2008: S. 23)
Die wieder aus der Zentrifuge herausgenommene Plasmid- / Markerlösung wird jetzt in eine
der Geltaschen pipettiert. Anschließend wird die Spannungsquelle angeschlossen. Dabei ist
zu beachten, dass der Minus-Pol an dem Ende angeschlossen wird, an der sich die
beladenen Probentaschen befinden und die Spannung maximal sieben Volt je Zentimeter
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Elektrodenabstand beträgt. In den nächsten 30 - 60 Minuten kann beobachtet werden, wie
die negativ geladene DNA zum Pluspol wandert. Dies wird durch den Gelladungspuffer
sichtbar gemacht, welcher die DNA-Proben daran hindert, „zu schnell wieder heraus zu
diffundieren […] [und] meistens aus Glycerin und zwei verschiedenen Farbstoffen besteht.
Das Glycerin erhöht die Dichte der Probenlösung im Vergleich zum Elektrophorosepuffer und
führt somit dazu, dass die Proben, wenn sie einmal in die Geltaschen pipettiert wurden, auch
dort ‚liegen bleiben‘. Die anionischen Farbstoffe dienen der optischen Kontrolle während der
Elektrophorese, da sie parallel zu den Nukleinsäuren durch das Gel wandern.“ (SCHMITT,
2008: S. 22)
3.6 Restriktionsverdau
„Eigentlich ist es ganz einfach. Man sucht sich aus der Enzymaktivitätsliste des Herstellers
den passenden Puffer aus, pipettiert DNA, Wasser, Puffer und Enzym zusammen, mischt gut
und inkubiert das Ganze für eine Stunde bei 37 °C.
Soweit die Theorie. Meistens funktioniert das auch. Meistens.“(MÜLHARDT, 2003: S. 45)
3.6.1 Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonucleasen
Eine Definiton hierfür wäre „(lat. restringere zurückziehen, öffnen): Enzym, das DNA an
spezifischen Basensequenzen schneidet.“ (LINDER, 2006: S. 546) MÜLHARDT bezeichnet sie
sogar als „wahre Wunder der Biologie, [weil] sie (je nach Spezifität) vier bis acht Basenpaare
in einem DNA-Strang erkennen […] [und] sie dabei von ungeheurer Präzision sind, denn sie
schneiden nur ihre Zielsequenz und […] nichts anderes.“(MÜLHARDT, 2003: S. 42)
In diesem Fall werden das Restriktionsenzym mit voller Aktivität Hind III, der
Restriktionsenzympuffer EcoR I mit Staraktivität und der dazugehörige Puffer TangoTM
benötigt.
Wo diese Restriktionsenzyme im
Plasmid pHAT-GFPuv ansetzen,
es dann auch schneiden und
welche Basenpaare davon
betroffen sind, wird in der
folgenden Abbildung dargestellt.
Hind III schneidet nach dem 141.
Basenpaar und EcoR I nach
dem 979. Basenpaar.
Abb. 6: Vektorbeschreibung des Plasmids pHat-GFPuv
(www.clontech.de, 2009)
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3.6.2 Durchführung
Mengenangaben:
• 1 µl Plasmidlösung
• 15 µl steriles, denaturiertes Wasser
• 2 µl zehnfach konzentrierter Puffer TangoTM
• 1 µl EcoR I
• 1 µl Hind III
Bevor man mit den eigentlichen Arbeitsschritten beginnt, sollte man zuerst den Inkubator
einschalten, damit sich dieser währenddessen auf 37°C erhitzen kann. Die verschiedenen
Komponenten werden nacheinander in ein Eppendorf-Cap pipettiert. Allerdings ist bei den
auf Eis gelagerten Restriktionsenzymen Vorsicht zu wahren, damit diese wirklich nur kurz
angetaut und nicht vollständig aufgetaut werden! Nachdem das Gemisch abzentrifugiert
worden ist, wird es für 30 - 60 Minuten in den Inkubator gestellt. Damit man sich hierbei nicht
die Finger verbrennt, sollte man darauf achten, nur das Epi zu berühren.
3.6.3 Analyse durch Gelelektrophorese
Abb. 7: kontrastbearbeiteter Abb. 8: GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder Gelausschnitt (2009) (www.fermentas.com, 2010 a)
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Wie in Abbildung 6 ersichtlich, schneidet Hind III nach 144 bp und EcoR I nach dem 979. bp.
Was wiederum eine Basenpaarlänge von 835 für das herausgeschnittene Plasmidstück
ergibt.
In den oberen beiden Abbildungen werden Gel und Markerskala zur Orientierung
gegenübergestellt.
Nach einer Kontrastbearbeitung des Bildes vom fotografierten Gel unter ultraviolettem Licht
werden im linken Bild das Bandenmuster des Markers (links) und das des Plasmids (rechts)
deutlich sichtbar. Zu erkennen ist, dass das erste der drei Banden des Plasmids über der
ersten Bande des Markers liegt, welcher bei 3000 beginnt. Das geschnittene Plasmid hat
eine Gesamtlänge von 3500 bp. Die dritte Bande des Plasmids im Gel ist kaum sichtbar, weil
dies das kleinste und damit leichteste DNA-Bruchstück des Plasmids ist. Es ist am weitesten
durch das Gel gewandert und stoppte bei ungefähr 840 bp; der Länge, die das
herausgeschnittene Plasmidstück haben sollte.
Somit war der Restriktionsverdau zwar erfolgreich, jedoch ist die Menge der
Plasmidbruchstücke für die Beendigung der GFP Klonierung in E.coli nicht ausreichend (die
Bande bei 837 bp kann gerade mal als roter Schatten gesehen werden).
4. Ausblick
Dass dieses Kapitel lediglich die Überschrift „Ausblick“ trägt und nicht weiter bis zum Ende
des Verfahrens führt, ist wohl meiner falschen Prioritätensetzung im vergangenen Jahr
zuzuschreiben. Wäre dies anders gewesen, wäre noch genügend Zeit geblieben, den
Restriktionsverdau erneut durchzuführen, um ein ausreichendes Ergebnis zu bekommen, mit
welchem man hätte weiter arbeiten können.
Bei einer ausreichenden Menge an Plasmidbruchstücken wird mit einer Elimination des
DNA-Fragments aus dem Plasmid pHAT-GFPuv fortgefahren: zunächst wird das DNA-
Fragment mit einem scharfen Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten, wobei noch
überschüssige Agarose zum Verkleinern des Stücks zusätzlich entfernt werden sollte.
Anschließend wird das Fragment in ein Reagenzglas gesteckt, gewogen und mit dem Puffer
QG im Verhältnis 3 zu 1 angereichert wird, wobei der Puffer in µl und das DNA-Fragment in
mg gemessen wird. Nun wird dies bei 50°C solange inkubiert, bis sich das Gel vollständig
aufgelöst hat (ca. zehn Minuten). Danach muss kontrolliert werden, ob die Farbe der
Mischung gelb ist. Wenn dies nicht der Fall ist und sich eine Orange- bis Lilafärbung zeigt, ist
der pH-Wert zu hoch und muss mit 10µl 3 M Natriumacetats, pH 5.0, ausgeglichen werden.
Anschließend wird Propanol im Verhältnis 1:1 hinzugefügt und durch vorsichtiges
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Schwenken untergemischt. Im Folgenden wird eine MinElute-Säule in ein 2ml Epi gesteckt,
das Gemisch daraufgegeben und für eine Minute zentrifugiert, um die DNA
zusammenzubinden. Nachdem der Überstand verworfen worden ist und die Säule zurück ins
Epi gesteckt wurde, werden 500µl des Puffers QG hinzugegeben und das ganze für eine
Minute zentrifugiert. Bevor nun zum Waschen der Säule 750µl des Puffers PE hinzugegeben
werden, wird der Überstand abermals verworfen und die Säule wieder zurück ins Epi
gesteckt. Dieser Überstand wird wieder verworfen und die Säule im Epi nochmals für eine
Minute zentrifugiert. Nun wird die MinElute-Säule in ein steriles 1,5 ml Epi gesteckt. Um die
DNA jetzt loszulösen, werden zuerst 10µl des Puffers EB direkt auf die Membran gegeben,
das Ganze dann eine Minute lang stehen gelassen und anschließend eine Minute lang
zentrifugiert. Die DNA hat sich von der Säule gelöst und befindet sich im Epi. (QUIAGEN,
2008)
Darauf folgend wird eine Klonierung dieses isolierten DNA-Fragments in pJET1.2/blunt
vorgenommen. Hierfür wird das CloneJetTM PCR Cloning Kit verwendet:
Abb. 9: Vector Map pJet1.2/blunt (www.fermentas.de, 2010 b)
“The kit contains a novel, ready-to-use positive selection cloning vector pJET1.2/blunt. The
vector contains a lethal restriction enzyme gene that is disrupted by ligation of a DNA insert
into the cloning site. As a result, only bacterial cells with recombinant plasmids are able to
form colonies. Recircularized pJET1.2/blunt vector molecules lacking an insert express a
lethal restriction enzyme which kills the host E.coli cell after transformation.”
(www.fermentas.com, 2010 a)
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Für ein Gesamtvolumen von 20µl werden folgende Komponenten benötigt:
• 10 µl 2 * Reaktionspuffer
• 2 µl PCR-Produkt
• 1 µl pJet1.2/blunt Klonierungsvektor
• 6 µl nukleasefreies Wasser
• 1 µl T4 DNA Ligase
Alle Komponente werden nacheinander in ein Epi pipettiert und nach kurzem Schwenken
drei bis fünf Sekunden lang zentrifugiert. Anschließend wird die Lösung bei 22°C für fünf
Minuten inkubiert. Nun muss die Lösung unmittelbar für die Transformation von Bakterien
verwendet werden (www.fermentas.com, 2010 b). Dies geschieht, wie folgt:
Es gibt mehrere Möglichkeiten, kompentente Zellen herzustellen. Zum einen kann für ein
schnelles Ergebnis das TransformAid™ Bacterial Transformation Kit verwendet werden.
Hierbei werden bis zu 2,5 µl der Ligasen – Reaktions - Mischung gebraucht, um 50 µl
kompetente E.coli Zellen zu transformieren, die zuvor mit diesem Kit vorbereitet wurden.
Zum anderen braucht man bis zu 5µl der Ligasen - Mischung um 50 µl derjenigen E.coli
Zellen, die durch die Calcium-Chlorid-Methode kompetent gemacht wurden, zu
transformieren.
Zu Beginn werden Agar – Ampicillin - Platten für mindestens 20 Minuten bei 37°C
vorgewärmt. Nachdem die E.coli - Zellen wie zum Beispiel im Protokoll des TransformAid™
Bacterial Transformation Kit beschrieben kompetent gemacht wurden, werden 2,5 µl der
Ligasen - Mischung in ein steriles Epi pipettiert und für zwei Minuten auf Eis gelegt. Darauf
folgend werden 50µl der kompetenten E.coli - Zellen hinzugegeben und für fünf Minuten auf
Eis inkubiert. Sofort im Anschluss muss das Gemisch auf die Agar – Ampicillin - Platten
ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. (www.fermentas.com, 2010 c)
5. Quellenverzeichnis
• Literaturverzeichnis
(1) LINDER, 2006: Linder Biologie Gesamtband, S. 546, 22., neu bearbeitete
Auflage, Braunschweig, Schroedel, ISBN 3507109301
(2) QIAGEN, März 2008: MinElute Handbook, S. 23 f
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(3) MÜLHARDT Cornel, 2003: Der Experimentator, Molekularbiologie/Genomics,
4.Auflage, München, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 3827414601
(4) SCHMITT Patrick, 2008: Einführung in die Grundarbeitstechniken der
Molekularbiologie
• Internetquellen
(1) www.biosicherheit.de, 2009: Gentechnik-Pflanzen-Umwelt, Lexikon, E.coli,
http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/97.ecoli_kolibakterien.html
(2) gfp.conncoll.edu, 2009: ZIMMER Marc, Green Fluorescent Protein, 18.11.2009,
http://gfp.conncoll.edu
(3) www.fermentas.com, 2010 a: CloneJetTM PCR Cloning Kit, Description,
http://www.fermentas.com/en/products/all/pcr-qpcr-rt-pcr/k123?print
www.fermentas.com, 2010 b: ZILINSKIENE Jurgita, CloneJetTM PCR Cloning Kit
Protocol, page 6
http://209.85.129.132/search?q=cache:tWlONKCKSeQJ:www.fermentas.com/te
mplates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_k1232.pdf+CloneJet%E2%84%A2+PCR+C
loning+Kit+Sticky-End+Cloning+Protocol&cd=2&hl=de&ct=clnk&gl=de
www.fermentas.com, 2010 c: ZILINSKIENE Jurgita, CloneJetTM PCR Cloning Kit
Protocol, page 8
http://209.85.129.132/search?q=cache:tWlONKCKSeQJ:www.fermentas.com/te
mplates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_k1232.pdf+CloneJet%E2%84%A2+PCR+C
loning+Kit+Sticky-End+Cloning+Protocol&cd=2&hl=de&ct=clnk&gl=de
(4) www.nugi-zentrum.de, 2010 a: Dr. STUPPERICH Erich, Autoklavieren,
Experimente, http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Grundlagen/
Autoklavieren.html
www.nugi-zentrum.de, 2010 b: Dr. STUPPERICH Erich, Ausstreichen,
Experimente, Kultivierungstechniken, http://www.nugi-
zentrum.de/Experimente/Mikrobiologie/Kultivieren/Methode.html
www.nugi-zentrum.de, 2010 d: Dr. STUPPERICH Erich, Plasmidisolation,
Experimente, http://www.nugi-
zentrum.de/Powerpoint_Dateien/Plasmid/Plasmidisolierung.ppt .
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• Abbildungsverzeichnis
Deckblatt: http://summercamps.dnalc.org/images/gfp_plate.png, 2010
Abbildung 1: gfp.conncoll.edu/, 2009: HADDOCK Steve, Aequorea victoria,
Bioluminescence, http://gfp.conncoll.edu/
Abbildung 2: mocrovet.arizona.edu/, 2010: The University Of Arizona 2007, Case
3: E.coli, http://microvet.arizona.edu/Courses/MIC419web/secure/
CaseEcoli/ EcoliEM4.jpg
Abbildung 3: www.nugi-zentrum.de, 2010 c: Dr. STUPPERICH Erich, Ausstrichart
auf Agaroberflächen, Experimente, Kultivierungstechniken,
Abbildung 4: www.nugi-zentrum.de, 2010 d: Dr. STUPPERICH Erich, Darstellung
der Anteile in einer Zelle, Experimente, http://www.nugi-
zentrum.de/Powerpoint_Dateien/Plasmid/Plasmidisolierung.ppt.
Abbildung 5: www.nugi-zentrum.de, 2010 d: Dr. STUPPERICH Erich, Schematische
Übersicht zur Plasmidisolation, Experimente
Abbildung 6: www.clontech.com, 2009: CLONETECH Laboratories, Inc., pHAT-
GFPuv+ Vector Information,
http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3312-5.pdf
Abbildung 7: Ergebnis der Gelelektrophorese, 2009: kontrastbearbeiteter
Gelausschnitt
Abbildung 8: www.fermentas.com, 2010 a: GeneRulerTM 100 bp Plus DNA
Ladder, Products, http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-
electrophoresis/generuler-dna-ladders/sm032
Abbildung 9: www.fermentas.com, 2010 b: pJet1.2/blunt,
6. Schülererklärung
Erklärung des Kollegiatin:
Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im
Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe.
Schlegelsberg, den 23.01.2010 ...............................................................
(Unterschrift der Kollegiatin)