Post on 29-Dec-2020
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Einführung in Zellanalyse und
Zellsortierung Modul-Seminar: Moderne molekulare und Hochdurchsatz-Technologien in der medizinischen
Grundlagenforschung, Master-Studiengang MBT
Johann Volzke, MSc. Biochemie
Universitätsmedizin Rostock
Zellanalyse
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 2
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Zellsortierung
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 3
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Durchflusszytometrie
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 4
• Automatisierte Messung von Zelleneigenschaften in
einem kontinuierlichen Probenstrom
• Zyto = Zelle / -metrie = „das Maß betreffend“
• Relative Beurteilung von Größe und Granularität
- Vorwärtsstreulicht (FSC)
- Seitwärtsstreulicht (SSC)
• Immunfluoreszenz
- (monoklonale) Antikörper + Fluorochrom spezifische Färbung
- zahlreiche Kombinationen von Ab und fluoreszierenden Farbstoffen
- „Panel-Design“: Zusammenstellung von Abs und Fluorochromen
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Probenvorbereitung
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 5
• Zellhaltige Probe
- Vollblut (antikoaguliert)
- Organe: Aggregate entfernen, Zellen
sieben/suspendieren
• Zellzählung (optional)
• Färbung
- Oberflächenmoleküle (CD, Rezeptoren, …)
- intrazelluläre Moleküle (DNA, Proteine) nach
Fixierung/Permeabilisierung
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Aufbau
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 6
• Strömungstechnik (Fluidics)
- Probe durch Leitungen befördern (Druck)
- Vereinzelung in Flusszelle durch hydrodynamische
Fokussierung
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Fluidics
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 7
• Zellen müssen einzeln
untersucht werden!
• Hydrodynamische
Fokussierung
- Zellen fließen nacheinander
durch Flusszelle
- Zellen werden nacheinander
„untersucht“
• Mantelflüssigkeit nicht mit
Probenkern mischbar
(Viskosität,
Fließgeschwindigkeit)
Probe
Mantelfl. Küvette
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Aufbau
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 8
• Strömungstechnik (Fluidics)
- Probe durch Leitungen befördern (Druck)
- Vereinzelung in Flusszelle durch hydrodynamische
Fokussierung
• optische Messeinheit (Optics)
- Anregung zur Fluoreszenz (LASER: Anregungs-Strahlung)
- Fokussierung, Weiterleitung und Registrierung von Streuung und
Emission
- Umwandlung der Signale in elektrischen Strom
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Optics
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• markierte Zellen werden
angestrahlt (--- --- ---)
- Streuung des anregenden
Lichts
- Anregung (versch.
Wellenlängen) und
Fluoreszenz
• Detektor: Photoeffekt
erzeugt Elektronen
LASER
„Sensing“-Region
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Registrierung von FSC und SSC
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• Registrierung von
gestreutem Licht einer
Wellenlänge
• SEV: „aus einem
mach viele“
FSC
SSC
Detektor
Detektor
„Abgedunkelt“
e-
e- e-
e-
e- e-
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
SEV
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Registrierung von Fluoreszenz
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11
• Fluoreszenz
- viele Wellenlängen
- gleichzeitige Registrierung
- werden durch Spiegel gefiltert (lassen bestimmte
Wellenlängen-Bereiche passieren)
- Licht gelangt erst danach zum Detektor
Fluoreszenz
Detektor e- e- e- e- e- e- e- e- e-
Filter
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Zellen
FSC
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Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 13
SSC und Emmision
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Strahlenfiltertypen
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longpass bandpass shortpass
520
LP
520
SP 530/60
BP
400 450 500 550 650 750
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Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 15
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Aufbau
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 16
• Strömungstechnik (Fluidics)
- Probe durch Leitungen befördern (Druck)
- Vereinzelung in Flusszelle durch hydrodynamische Fokussierung
• optische Messeinheit (Optics)
- Anregung zur Fluoreszenz (LASER: Anregungs-Strahlung)
- Registrierung und Lenkung der Streuung und Emission
- Umwandlung der Signale in elektrischen Strom
• Elektronik (Electronics)
- Weiterleitung des elektrischen Stroms
- Verstärkung des elektr. Stroms und Umwandlung in
Spannungsimpulse
- Konvertierung in digitale Werte Auswertung
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Electronics
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Photonen Detektor + SEV elektr. Strom
e- e-
e- e- e- e- e- AMP Daten
Verstärkung + Spannungsimpuls
Photokathode (-)
Anode (+) Primärelektron Sekundärelektronen
Detektorspannung ↑: Anzahl Sekundärelektronen↑
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Electronics
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Photonen Detektor + SEV elektr. Strom
e- e-
e- e- e- e- e- AMP Daten
Verstärkung + Spannungsimpuls
Zeit
V V V V V
Fluoreszenz
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Spannungsimpuls
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• Signal wird stärker wenn (je Detektor)
- Zelle größer (FSC)
- Zelle granulärer (SSC)
- Zelle mit mehr gebundenen Ab (Fluoreszenz)
- Zelle mit erhöhter Fluoreszenz durch weitere Farbstoffe (z.B.
Interkalatoren)
• Dubletten: Aggregation führt zu unerwünscht erhöhten Signalen
(Zeit-Komponente und damit Fläche werden größer)
t1 < t2
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Leukozytenanalyse
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 20
Trümmer
Lymphozyten
Monozyten
Granulozyten
Leukozyten
Signalhöhe oder -fläche = Intensität
Dotplot
• Morphologie sehr ähnlich: Grobe (relative)
Unterscheidung in Größe und Granularität
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CD Moleküle
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 21
• Leukozyten und Subpopulationen: Färbung von
spezifischen Oberflächenmolekülen
CD45 Leukozyten
CD3 T-Zellen
CD4 T-Helferzellen
CD8 Zytotoxische T-Zellen
CD19 oder CD45R (B220) B-Zellen
CD16 und CD56 NK-Zellen
CD14 Monozyten
… …
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Histogramm
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 22
• Leukozyten und Subpopulationen: Färbung von
spezifischen Oberflächenmolekülen
CD3- CD3+
T
CD45 CD3
CD3 Ab + Fluorochrom
Histogramm
MFI
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Hierarchisches Gating im Dotplot
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 23
• Beispiel: Analyse von T-Zellen in Vollblutprobe
- Anteil der T-Zellen (CD3+) an Lymphozyten?
- Anteil der T-Helferzellen (CD4+) an T-Zellen?
„parent gate“ ≙ 100 %
der Messereignisse (Events)
CD3+ CD3-
„child gates“ ≙ Anteile am
parent gate*
25 %* 75 %*
neues „parent gate“
65 %
35 %
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Hierarchisches Gating
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 24
• Beispiel: Analyse von B-(CD19+) und NK-(CD16/56+)
Zellen aus Vollblutprobe
- Anteil von B-Zellen und NK-Zellen an Lymphozyten?
15 %
5 %
80 %
versch. Emissions- Wellenlängen
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Reinheitsanalyse
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 25
• B-Zellen aus Milz isoliert (Reinheit? )
- „Verunreinigung“ durch T-Zellen?
95 %
3 %
Zellen
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Analyse von Apoptose
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 26
• lebende Zellen: Asymmetrie
von Lipiden
- katalysiert durch
Flippase und Floppase
• Caspase: Aktiviert Scramblase
• Scramblase hebt Assymetrie
auf
• Phospatidylserin zeigt bei
Apoptose in den
Extrazellulärraum
• PS wird durch Annexin
gebunden
Extrazellulär
Intrazellulär
polarer Phospholipidrest
Phosphatidylserin
Caspase-Aktivierung und Apoptose
Annexin
Fluorochrom
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Analyse von Apoptose und Zelltod
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 27
• Kombination mit DNA-
Interkalatoren
- Propidiumiodid (PI) / 7-AAD
• Unterscheidung von bereits
gestorbenen Zellen
(Membranintegrität)
• Lebende Zellen: FITC− PI−
• Apoptose: FITC+ PI−
• Tot: FITC+ PI+
• DNA-Fragmente: FITC− PI+
PI / 7-AAD
DNA
Annexin-FITC FITC
PI
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Multiplex-Analyse
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 28
• Prinzip des Sandwich-ELISA
• Gleichzeitge Quantifizierung von bis zu 30 Antigenen in einer Probe
• z.B. Zytokine
2
1
1
unterschiedlich
fluoreszierende Beads
Analyten (Zytokine)
Zytokin-spezifische AK
Detektions-Ab
Analyse
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Multiplex-Analyse
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 29
Beadpopulation 1
- gleiche Größe
- 6 sub-Populationen mit
unterschiedlicher
Autofluoreszenz und
Zytokin-Reaktivität
Beadpopulation 2
- gleiche Größe
- 7 sub-Populationen mit
unterschiedlicher
Autofluoreszenz und
Zytokin-Reaktivität
Signal von Nachweis-Ab
Bead
Fluoreszenz
SSC
FSC
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Aspekte der Planung von Zellanalysen
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 30
• Komponenten von Zellanalysen können auf unerwünschte Weise
Messungen beeinflussen
- Zellen: Autofluoreszenz (z.B. NAPDH) und Aggregation
(Dubletten)
- Antikörper: unspezifische Bindung (z.B. über Fc)
- Farbstoffe: Überlagerung von Emissionsspektren
• „Design“ der Analyse: geeignete Kontrollen wählen und
Durchflusszytometer einstellen
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Betrachtung von Populationen
ist immer relativ!
Detektor-Spannungen in beiden Kanälen anpassen
Autofluoreszenz
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 31
• Biologische Kontrolle: Vorab-Messung von ungefärbten Zellen
- Detektorspannung (Beschleunigung der Elektronen im SEV) am
Messgerät einstellen
- scheinbar positive Signale in „negativen“ Bereich schieben (empirisch)
Ausnutzung des dynamisches Bereichs
+ - + -
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Dublettenausschluss
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 32
• Nicoletti-Assay: Anfärbung
von DNA nach Fixierung
und Permeabilisierung von
Zellen (Zellzyklusanalyse)
• Dubletten führen zu
unsinnig vielen „Peaks“
- zwei Zellen haben mehr
DNA als eine
• Dubletten-Ausschluss
- Plot von Signalbreite
gegen Signalfläche
(Interkalator-Emission)
- Gating der Einzelzellen
PI
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Unspezifische Antikörperbindung
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 33
• Bindung über Fc?
• Probenvorbereitung
- „Fc-Block“ Blockieren FcR
- Verwendung von k/o Zellen
als Negativ-Kontrolle
• Isotyp-Kontrolle
- Antikörper mit gleichem Isotyp
(leichte/schwere Kette) und
Fluorochrom
- keine Spezifität für Antigene
in der Probe
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Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 34
Spektrale Überlappung
• Verwendung von vielen Farbstoffen in einer
Probe: Überlappung der Emissionsspektren
möglich
PE-Cy7 strahlt in den Detektor-Kanal von PE (ca. 570 nm) rein
ThermoFischer Fluorescence SpectraViewer
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Spektrale Überlappung und Kompensation
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 35
• Verwendung von Kontrollen: Zellprobe nur mit einem
Farbstoff inkubiert
• betroffenen Kanal / betroffene Kanäle betrachten
• Abschätzen der Überlappung und Subtraktion:
Kompensation
Zellen + Ab(PE-Cy7) kompensiert Zweifachfärbung
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Kompensation
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 36
Zweifachfärbung
PE Kanal: (PE + PE-Cy7 Überlappung) - (PE-Cy7 Überlappung) =
korrigiertes Signal für PE
=> Doppelt positive Populationen auswertbar
• Verwendung von Kontrollen: Zellprobe nur mit einem
Farbstoff inkubiert
• betroffenen Kanal / betroffene Kanäle betrachten
• Abschätzen der Überlappung und Subtraktion:
Kompensation
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Fluorescence Minus One (FMO)
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 37
• bei Verwendung eines „multi-color“ panels
• Abschätzen inwiefern einzelne Fluorochrome in andere Kanale strahlen
• unvermeidbar auf Grund logarithmischer Darstellung und spektraler
Überlappung
PE
FITC
0
102
103
104
105
0 102 103 104 105
PE
FITC
0
102
103
104
105
0 102 103 104 105
PE
FITC
0
102
103
104
105
0 102 103 104 105
ungefärbte Kontrolle FMO Kontrolle Vollständig gefärbt
FITC --- CD45RO CD45RO
PE --- --- CD45RA
Cy55PE --- CD4 CD4
ungefärbt Grenze ungefärbt Grenze ungefärbt Grenze
FMO Grenze
Falsch positiv
FMO Grenze
FITC+
PE−
FITC−
PE+
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Zellsortierung
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 38
• Isolation gewünschter Zellpopulationen
• Depletion unerwünschter Zellpopulationen
• Aufreinigung
• Wahl der Methode: Reinheit, Ausbeute, Stress auf Zellen
und Art der Downstream-Anwendungen (z.B. Zellkultur)
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Durchflusszytometrische Zellsortierung
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 39
• Datenabhängige Zellsortierung
• Zielzellen markiert (Ab +
Fluorochrom)
• Tröpfchenbildung am Ende
einer Düse
• Tropfen werden je nach Signal
positiv bzw. negativ elektrisch
geladen
• Sortierung erfolgt über elektr.
geladene Ablenkplatten
• hohe Reinheit aber hoher
Stress für Zellen (EM-Felder,
Fragmentierung nach
Tröpfchenbildung) und
Aktivierung von Zellen
möglich (z.B. T-Zellen)
„Sensing“
„Drop- Delay“
Tropfen mit Zelle
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Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS®)
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 40
• magnetisch markierte Zellen
werden retardiert
• waschen der Säule
• Elution durch Schwerkraft
oder Druck (autoMACS)
• schonend für Zellen (geringer
Stress) hohe Ausbeute
Magnetische Markierung
magnetisches Objekt (bead)
Ab
Magnetische Sortierung Elution der markierten Zellen
N
S
ferromagnetisches Säulenmaterial
„Negativfraktion“
N
S
„Positivfraktion“
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Zellsortierung nach Größenausschluss
Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 41
• künstlich vergrößerte Zellen
bleiben auf Zellsieb zurück
• waschen!
• Ablösen der Zielzellen von
beads (chemisch vermittelt)
• „schonende“ Prozedur
Markierung und Vergrößerung
Ab
bead (d = 30 - 70 µm)
Sortierung nach Größe
„Negativfraktion“
Gewinnung der Zielzellen
„Positivfraktion“