Post on 25-Aug-2019
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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik
Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Dr. Stefan WeinlInstitut für Biologie &Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7
Schwerpunkte:
Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: ReportergeneVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine
Transgene Organismen
"Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einerWeise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzenoder natürliche Rekombination nicht vorkommt"
Gentechnik Gesetz
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„Postgenomics“ – Die Ausgangssituation
Transgene Pflanzen: das Grundprinzip der Transformation
DNA Vektor Übertragungsweg Zielorgan(ismus)
z.B. - cDNA
- genDNA
z.B. - Ti-Plasmid- Plasmid mit
pflanzlichenSteuersequenzen
z.B. - Agrobakterium-Transformation
- Partikel-Kanone- Elektroporation
z.B. - ganze Pflanze- Blattscheiben- Protoplasten- Wurzeln
aber auch:- Kerntransformation- Plastidentransformation
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stabile Transformation:
Integration in das Genom des Empfängerorganismus
dauerhaft exprimiert und vererbt
i.d.R. Expression einer Genkopie
transiente Expression:
Expression der Fremd-DNA im Zytoplasma des Empfänger (i.d.R. ohne Replikation)
nur für einen begrenzten Zeitraum exprimiert (nicht vererbt)
(i.d.R. (Über-)Expression von zahlreichen Genkopien)
stabile und transiente Transformation
stabile Transformation:
Integration durch nichthomologe Rekombinationz.B. Säuger: Injektion in Eizellen, retrovirale Vektoren
Integration durch homologe Rekombinationz.B. Hefe: Transformation mit linearer DNA und Selektion des Markergens
Partikelbombardierung und Rekombination (z.B. Pflanzen) T-DNA vermittelte Transformation (z.B. Pflanzen)
transiente Expression: Transfer von Plasmid DNA in Zellkulturen (z.B. chemisch, Elektroporation,
Säuger: Transfektion) Transiente Transformation mit Agrobakterien (Zellkulturen, Blätter) Partikelbombardierung
stabile und transiente Transformation
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Prinzip der Transformation: das Ti-Plasmid
vir-Gene
ori
tra
nocTi-Plasmid
modifizierte Transfer-DNA (T-DNA)LB RBPromotor Gen X Terminator Selektionsmarker
Prinzip der Transformation: das Ti-Plasmid
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Requirements for (plant) transformation
1. Selectable marker gene
kanamycin resistance: neomycin phosphotransferase (nptII),
hygromycin B: hygromycin phosphotransferase (hygB)
streptomycin: streptomycin phosphotransferase
herbicide bialaphos (phosphinothricin, BASTA): bacterial gene bar encoding the BASTA-inactivating enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT)
2. Promoter (constitutive, tissue-specific or inducible)
3. coding region
4. polyadenylation site
Transformation von Arabidopsis: Tauchtransformation
Agrobacterium Kultur 28°C 2 Tage
“Dipping” ( 5% Sucrose + 0.03% L-77 )
Kultivierung in Anzuchtschrank für 2 – 3 Wochen
Samen Reifung (Trocknung)
Selektion (oberflächensterilisierte Samenauf Gewebekulturmedium
mit Kanamycin)
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Prinzip der Transformation: Infektion und Regeneration
Transformation von Pflanzen: Promotor-Reportergen-Fusionen
Prinzip:
Gen X:ATG TAA
cod. RegionPromotor
GUSPromotor
Transformationsvektor
GUSPromotor
X
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Transformation von Pflanzen: Promotor-Reportergen-Fusionen
Prinzip:
Gen X:ATG TAA
cod. RegionPromotor
GUSPromotor
Transformationsvektor
GUSPromotor
XPromotor cod.Region
ATG TAA
Promotor cod.RegionATG TAA
Promotor cod.RegionATG TAA
Promotor cod.RegionGUSATG TAA
Promotor cod.RegionATG TAA
Transformation von Pflanzen: Protein-Reporterprotein-Fusionen
Zellkultur
CBL1::GFP
Prinzip:
ATG TAA
GFPGen
Transformationsvektor
Pflanze
CRY2::GFP
Promotor
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Transgene Pflanzen: Struktur- Funktions-Untersuchungen
Gen X: ATG TAA
x
Gen
GUS
GUS
GUS
GUS
Protein
GFP
(Komplementation von Mutanten)
X
GFP
GFPX
ATG TAA
Mutante
Transformation von Pflanzen: Über-Expression von Genen
- Viraler Promotor (CaM)- Konstitutive Expression- starker Promotor
Prinzip:
ATG TAA
Gen XProm.
Transformationsvektor
XGen X35S
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Transformation von Pflanzen: Über-Expression des CBL1-Gens
CBL1
RD29A
CBF1
CBF2
PR1
actin
WT cbl1 35S35S-Prom CBL1 Term
planttransformation
Transformation von Pflanzen: Methoden
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Biolistic (biological+ballistic) transformation
Gene guns
Biolistic (biological+ballistic) transformation
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Biolistic (biological+ballistic) transformation
Transiente Expression des GUS-Reporter Genesin Blättern nach Partikelbombardierung
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Transiente Expression des GFP-Reporter Genesin Zwiebeln nach Partikelbombardierung
(onion epidermal cells transiently transformed with CBL6::GFP)
Stabile Transformation nach Partikel-Bombardierung
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Anwendung der Partikelbombardierung:Die Transformation von Plastiden
Gentransfer durch homologe Rekombination
Anwendung der Partikelbombardierung:Die Transformation von Plastiden
Gentransfer durch homologe Rekombination
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Anwendung der Partikelbombardierung:Die Transformation von Plastiden
Regeneration der transgenen Pflanzen
BlattscheibeRegenerationsmedium
mit Antibiotika
Resistenter Callus mit sich regenerierender Pflanze
Stabile Transformation von Pflanzenzellen
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CDPK
Syntide-2 - P
Syntide-22-3 d
Transiente Expression: Injektion von Agrobakterien
Plasmid
Agrobacterium
1 Infiltration of Agrobacteriumcontaining NtCDPK2-myc
2 TreatmentBiotic stress (elicitor, Cf-9/Avr9)Abiotic stress (wounding, flooding)
3 Preparation of extractsWestern blot analysis
5 Immunoprecipitation in vitro kinase assay
time course
4 Signallingresponses
Transiente Transformation von Pflanzenzellen
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Transiente Transformation von Pflanzenzellen
Funktionsaufklärung von Genen (und ihren Produkten)durch Reverse Genetik
Methoden der Reversen Genetik zur Funktionsaufklärung:
zwei grundlegende Möglichkeiten:
A) gerichtete Mutagenese B) zufällige Mutagenese
1. Rekombination (A, B)
2. T-DNA Insertions-Mutagenese
3. Transponible Elemente
4. RNA Interferenz
5. CRISPR/Cas9
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„forward / reverse genetics“
1. „forward genetics“-Vorwärts-Genetik: vom Phän (otyp) zum Gen(otyp)
Ausgangssituation: „Ich isoliere eine interessante Mutante (d.h. ich analysiere das äußere Erscheinungsbild einer mutierten Genfunktion), kenne aber nicht die Sequenz des dazugehörigen Gens“
Experimentelle Situation und Strategien:
Erlauben: - Beschreibung der Genfunktion
Erfordern: - Gezielte Kartierung des Mutantenallels und die Isolierung des Gens
2. „reverse genetics“-Reverse Genetik: vom Gen(otyp) zum Phän(otyp)
Ausgangssituation: „Ich kenne die Sequenz eines Gens, weiß aber nichts über seine Funktion“
Experimentelle Situation und Strategien:
Erlauben: - Gezielte Isolation einer Mutante
Erfordern: - Suche nach dem Phänotyp der Mutante
„forward / reverse genetics“
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Reverse Genetik
Funktion ?
Insertion
- zerstört/verändern Genfunktion- markiert gleichzeitig das Gen
Genotyp:Bekannte Sequenz eines Gens
Mutagenese/Auffinden einer Mutante:(Mutationsereignis im Genmuss erkennbar sein)
- zufällig (T-DNA, Transposon)
- gerichtet („homologe Rekombination“):nicht in pfl.Kergenom, aber Plastom
Phänotypische Analyse
Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Hefe
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Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Hefe
Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen
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Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen
Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen
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Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen
Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen
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Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen
Herstellung transgener Mäuse durch zufällige Integrationvon Fremd-DNA
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Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-outs“durch das cre-lox System
Notwendige Elemente:
loxP-DNA-Sequenzen: locus of X-over P1
Cre-Rekombinase: causes recombination oder Cyclization recombinase
13bp 8bp 13bp
ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT
Die Sequenz zwischen den Lox-Sequenzen wird durch Rekombination entfernt
Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-outs“durch das cre-lox System
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Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-ins“durch das cre-lox System
Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-ins“durch das cre-lox System
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Reverse genetics: T-DNA-insertion mutagenesis
LB T- DNA RB
vir-Gene
ori
tra
noc
Agrobacterium tumefaciens- enthält das Ti-plasmid- T-DNA (Region zwischen „left“ und „right“ Border)
Reverse Genetik durch T-DNA-vermittelte Insertionsmutagenese
...
Insertion
ATG TAA
Insertion
ATG TAA
Insertion
ATG TAA
T-DNA
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PCR-Analyse von T-DNA-Insertionen
Mutante mit Insertion Wildtyp ohne Insertion
S+LB S+LB A+RB A+RBwt mut wt mut
Marker
T-DNALB A
RBS S
A
Herstellung von Mutantenpopulationen
BASTA
Tauch-Infiltrationmit Agrobakterium
Samenernte Selektion mit BASTA Isolierung von Insertionslinien
•Sequenzierung der flankierenden T-DNA Bereiche = FST: „flanking sequence tag“
•Bereitstellung der FST Sequenzen in einer Datenbank
•Sequenzvergleich der FSTs mit dem gewünschten Gen
•Bestellen des Samenpools, Isolierung und Verifizierung der gewünschten Mutante
•Phänotypische Analyse
Kommerzielle Generierung großer Mutantenpopulationen
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Charakterisierung von Mutantenpopulationen
SP1 SP2 SP3AP AP
SP1 AP
SP2 AP
SP3 AP
AP
E E
E E
Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL) PCR:
Adaptor PCR:
Datenbankanalyse für Insertionsmutanten
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Transposon-induced mutants
DNA elements capable of moving ("transposing") about the genome
Discovered by Barbara McClintock, largely from cytogenetic studies in maize, but
since found in most organisms
She was studying "variegation" or sectoring in leaves and seeds
She liked to call them "controlling elements“ because they affected gene expression
Transposon-induced mutants
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T-DNA-induced mutants / Transposon-induced mutants
T-DNA-induced mutants:
- easy to establish in Arabidopsis
- technically restricted to Arabidopsis
- random distribution of insertions
- low insert copy number
Transposon-induced mutants:
- endogenous/heterologous transposons
- generation of stabilized transposons is genetically
complicated
- extends technology to other species
- allows generation of multiple allels and revertants
- non random distribution in genome
- can have high insert copy number
Transposon-induced mutants
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Verschiedene RNAi Mechanismen
Intron
Anwendung von RNAi in Pflanzen
LB T- DNA RB
vir-Gene
ori
tra
noc
Annealing
Splicing
Transkription
in planta
Targeting
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Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference)
Dicer
Targeting
dsRNA
small dsRNA(ca. 21-24 nt mit 2 Nucleotid Überhang)
RISC (RNA Induced Silencing Complex)mit Argonaute Protein
mRNA
small ssRNA (siRNA) mit RISC
Silencingnächste mRNA
Komplexbindung an endogene,komplementäre mRNA Abbau der mRNA
CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas9-Mechanismus
CRISPR/Cas9 Vorteile
Im Vergleich zu den anderen Genome Editing-Verfahren hat CRISPR/Cas9 folgende Vorteile:
Transgene Organismen sind einfacher herzustellen
Sehr viel schneller als herkömmliche Methoden
mehrere Genomveränderungen gleichzeitig durchgeführt werden
Kostengünstiger
In vielen Organismen verwendbar
CRISPR/Cas9 arbeitet es weitaus präziser