Post on 04-Aug-2019
transcript
1
Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerb randverletzte,
Handchirurgiezentrum, Operatives Referenzzentrum fü r Gliedmaßentumore
der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannshe il – Universitätsklinik -
der Ruhr – Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. U. Steinau
Antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vitro
und in infizierten Brandwunden
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrad es der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr – Universität Bochum
vorgelegt
von Alexander Baraniskin
aus Donezk
2005
2
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Juniorprofessor Dr. med. Lars Steinsträss er
Korreferent: PD Dr. rer. nat. Anneliese Bohn
Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2007
3
Inhaltsverzeichnis: Seite
1. EINFÜHRUNG
1. 1. Verbrennungen und ihre Folgen
1. 1. 1. Epidemiologie der Verbrennungen
1. 1. 2. Pathophysiologie des Verbrennungstraumas
1. 2. Haut ist das größte Immunorgan
1. 2. 1. Elemente der Immunantwort
1. 2. 2. Rolle des angeborenen Immunsystems nach
Verbrennungen
1. 3. Probleme der Antibiotikatherapie
1. 4. Antimikrobielle Peptide
1. 4. 1. Entdeckung der antimikrobiellen Peptide
1. 4. 2. Einteilung der antimikrobiellen Peptide
1. 4. 3. Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems
1. 4. 4. Klinische Studien mit antimikrobiellen Peptiden
1. 5 Humanes Histon
1. 4. 5. Histonproteine als weitere Effektormoleküle der angeborenen
Immunabwehr
1. 5. 2. Intranukleäre Aufgaben der Histonproteine
1. 5. 3. Funktionen des Histon H1
1. 6. Ziel dieser Studie
2. MATERIAL UND METHODEN
2. 1. Getestete Substanzen
2. 2. Verwendete Mikroorganismen
5
5
5
6
7
7
9
10
15
15
16
16
18
18
18
19
21
22
23
23
24
4
Inhaltsverzeichnis: Seite
2. 3. In vitro Untersuchungen
2. 3. 1. Radiale-Diffusion-Verfahren
2. 3. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon-Verdünnungs-Verfahren
2. 3. 3. Hämolytische Aktivität des Histon H1.2
2. 3. 4. Zytotoxische Aktivität des Histon H1.2
2. 4. In vivo Untersuchung: Infiziertes Ratt enverbrennungsmodell
2. 5. Statistische Analyse
3. ERGEBNISSE
3. 1. In vitro Aktivität von Histon H1.2
3. 1. 1. Radiale-Diffusion-Verfahren
3. 1. 1. 1. Grampositive Bakterien
3. 1. 1. 2. Gramnegative Bakterien
3. 1. 1. 3. Pilze
3. 1. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon-Verdünnungs-Verfahren
3. 1. 3. Hämolytische Aktivität
3. 1. 4. Zytotoxische Aktivität
3. 2. In vivo Aktivität von Histon H1.2
4. DISKUSSION
5. ZUSAMMENFASSUNG
6. LITERATUR
7. DANKANSAGUNG
8. LEBENSLAUF
25
25
28
31
32
33
39
40
40
40
40
42
43
45
46
48
49
52
65
66
81
84
Alexander Baraniskin Einführung
5
1. EINFÜHRUNG
1. 1 Verbrennungen und ihre Folgen
1. 1. 1 Epidemiologie der Verbrennungen
Brandwunden zählen unter den traumatisch bedingten Verletzungsarten zu den
schwersten. In Deutschland erleidet alle siebzehn Sekunden ein Mensch eine
Brandverletzung. Im Raum der Europäischen Union werden statistisch jedes
Jahr ca. 3.500.000 Menschen Opfer einer thermischen Verletzung 26. Diese
Zahl erfasst lediglich die ärztlich versorgten Patienten, wobei die Dunkelziffer
vermutlich bei 10.000.000 im Jahr liegt 26. Allein in Deutschland sind jährlich
zwischen 6.000 und 10.000 Menschen von schwersten Verbrennungen
betroffen, davon sind ungefähr 2.000 Kinder 26. Ungefähr 700 Menschen
sterben jedes Jahr an den Folgen der Verbrennungen, wobei nicht die
Verletzungen selbst, sondern die Infektionen der Wunden durch
Mikroorganismen heutzutage immer noch das größte Mortalitätsrisiko bei
Schwerbrandverletzten darstellen 26.
Das Ausmaß der Schädigung durch die Verbrennung wird von der
Verbrennungstiefe und der Höhe bzw. der Einwirkungsdauer der Temperatur
bestimmt. Ist die intrakutan auftretende Wärme relativ niedrig, also geringer als
100 °C (z. B. bei Kontakt mit heißen oder ko chenden Flüssigkeiten sowie mit
Wasserdampf), so spricht man von einer Verbrühung. Eine Verbrennung ist
eine durch thermische Einflüsse, z.B. durch Flammenwirkung (900 °C mittlere
Flammentemperatur) ausgelöste schwere Schädigung der Haut und zum Teil
der darunter liegenden Geweben, mit nachhaltigen Auswirkungen auf den
gesamten Organismus 4,13.
Alexander Baraniskin Einführung
6
Die Haut ist aufgrund ihres hohen Wassergehaltes ein schlechter Wärmeleiter.
Allerdings erfolgt auch die Abgabe der einmal aufgenommenen Wärme
entsprechend langsam, so dass es zum Phänomen des "Nachbrennens"
kommt. Die Hitzeeinwirkung im Gewebe hält dabei wesentlich länger an, als
die Dauer der äußeren Einwirkung. Daraus resultiert, dass die thermische
Schädigung der Haut auch nach Beendigung der äußeren Hitzeeinwirkung
fortschreitet 66.
1. 1. 2 Pathophysiologie des Verbrennungstraumas
Eine Verbrennung löst gravierende pathophysiologische Veränderungen aus.
Aufgrund von Kapillarschädigung durch die lokale Brandverletzung bzw.
systemisch durch eine Freisetzung von vasoaktiven Mediatoren, z. B. von
Prostaglandinen, Kininen und Histaminen kommt es zu einer Permeabilitäts-
erhöhung für Moleküle bis 106 Dalton 4. Es entsteht ein massives Ödem mit
einem generalisierten, intravasalen Wasser-, Elektrolyt- und Proteinverlust.
Zusätzlich wird der Flüssigkeitsverlust durch Exsudation über die Wunden nach
außen verstärkt. Die intravasale Hypovolämie führt durch eine reaktive
Vasokonstriktion und Erhöhung der Blutviskosität zu einer Mikrozirkulations-
störung mit peripherer Minderperfusion und metabolischer Azidose 4,66.
Alexander Baraniskin Einführung
7
1. 2 Haut ist das größte Immunorgan
1. 2. 1 Elemente der Immunantwort
Die Verbrennung führt zur lokalen Zerstörung der Haut, die als ein großes
Immunorgan des Menschen eine wichtige Barriere zwischen Umwelt und
Körper darstellt. Das angeborene Immunsystem der Haut sorgt für eine
geringe Inzidenz von Infektionen und inflammatorischen Komplikationen bei
gesunden Hautoberflächenstrukturen und stellt die wichtigste Waffe der
epithelialen Abwehr dar 71. Es wird durch das thermische Trauma komplett
eliminiert.
In jüngster Zeit rückt das angeborene Immunsystem zunehmend in den
Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Das angeborene Immunsystem
ist das phylogenetisch ältere Immunsystem 39. Es stellt die erste, schnelle und
unspezifische Abwehr gegen Mikroorganismen dar.
Die Basis des angeborenen Immunsystems bilden die antimikrobiellen Peptide,
wie zum Beispiel Defensine und Lysozym (Tab I).
Medizinhistorisch ist Lysozym das Effektormolekül des angeborenen
Immunsystems welches erstmalig 1929 durch einen Zufall von dem
schottischen Wissenschaftler Alexander Fleming entdeckt und beschrieben
wurde. Als Alexander Fleming, der später auch das Penicillin entdeckte, eines
Morgens mit einem starken Schnupfen seine Agarplatten kontrollierte, fiel
versehentlich ein Tropfen Nasensekret auf eine Platte, die eine große Kolonie
einer Verunreinigung enthielt. Dort, wo das Sekret auf die Verunreinigung
getropft war, wurde die Kolonie heller. Fleming schloss aus dieser
Beobachtung, dass das Nasensekret eine Substanz enthalten muss, die diese
Bakterien lysieren kann 86.
Alexander Baraniskin Einführung
8
1963 wurde Lysozym von Canfield und von Jolles sequenziert und 1965 die
Struktur röntgenkristallographisch aufgeklärt 86.
Tabelle I: Bestandteile des angeborenen Immunsystems.
Elemente des angeborenen Immunsystems Beispiele
� anorganische Moleküle HCl, NO 39
� kleine organische Moleküle Fett-, Milchsäure 39
� antimikrobielle Peptide Defensin, Lysozym 62
� bindende Proteine Mannose-Bindende-Proteine 45,87
� Zytokine IL-10, IL-12 4
� Carbohydrate PGG-glucan 45,57
� Zellen Makrophagen, Neutrophile 62
Das angeborene Immunsystem der Haut verfügt über weitere mechanische,
chemische und biologische Mechanismen, um eine Invasion von pathogenen
Mikroben zu verhindern 62. Die Hornschicht und die Tight Junctions zwischen
den Hautzellen verkörpern ein physiologischerweise vorhandenes mechanisches
Hindernis gegen Erreger 71. Neben der mechanischen Barriere verfügt die Haut
über den so genannten Schutzmantel, der als eine natürliche, chemische
Permeabilitätsschranke dient. Es ist die interzelluläre Lipidschicht der Hornhaut,
die aufgrund ihres Gehaltes an Milch - und Fettsäuren einen niedrigen pH –
Wert von 5,5 aufweist 4. Die primär apathogene, symbiotische Hautflora
bewahrt ihrerseits das Hautorgan vor einer Besiedelung mit pathogenen
Keimen 13.
Alexander Baraniskin Einführung
9
Bei Insekten und Amphibien stellt das angeborene Immunsystem die
Hauptabwehr gegen Erreger dar. Höherentwickelte Spezies wie die Säugetiere
besitzen zusätzlich das phylogenetisch jüngere erworbene Immunsystem,
dessen Hauptkomponenten T- und B-Lymphozyten sind und das für die
spätere, spezifische Immunantwort zuständig ist 39. Nach Stimulation durch ein
Antigen oder durch T-Lymphozyten differenzieren sich B-Lymphozyten zu
Plasmazellen und sezernieren dann antigenspezifische Antikörper in das
umgebende Milieu. Damit das erworbene Immunsystem seine maximale Aktivität
entfalten kann, muss es beim Erstkontakt erst zur klonalen Expansion von B-
und T-Lymphozyten kommen, die Tage bis Wochen in Anspruch nimmt.
Infolgedessen steht das angeborene Immunsystem sowohl zeitlich als auch
räumlich vor dem erworbenen Immunsystem 71.
1. 2. 2. Rolle des angeborenen Immunsystems nach Verbrennungen
Die thermische Schädigung führt zum Kollaps des angeborenen Immunsystems
mit verminderter Produktion antimikrobieller Peptide, die als erste Hürde gegen
Mikroorganismen eine bedeutsame Rolle in der Vermeidung von
Wundkontaminationen spielen 31. Ortega untersuchte die Expression der
antimikrobiellen Peptide: der humanen Defensine 1 und 2 gesunder und
verbrannter Haut, und stellte fest, dass in der verbrannten Haut keine
Defensine mehr vorkommen 49.
Die großflächige Zerstörung der Hautbarriere bei Schwerbrandverletzten führt in
der Regel zur Kolonisierung der Wundfläche mit pathogenen Mikroorganismen.
Zur Entstehung von systemischen Infektionen kommt es durch die hämatogene
Invasion von Mikroorganismen aus einer lokalen Infektionsquelle.
Alexander Baraniskin Einführung
10
Die Freisetzung der Erregerbestandteile und Toxine löst eine
Mediatorenkaskade aus, die zum Versagen der Organsysteme und damit zum
fulminanten septischen Schock führen kann. Aus diesem Grund ist die
großzügige Nekrektomie der verbrannten Areale mit anschließender
Spalthauttransplantation derzeit der Goldstandard in der klinischen Versorgung
von Schwerbrandverletzten. Eine erfolgreiche Spalthauttransplantation ist jedoch
nur dann möglich, wenn die Haut weniger als 106 Bakterien pro Gramm
Gewebe enthält 75.
Die Letalitätsrate bei Schwerbrandverletzten mit systemischen Infektionen liegt
in Europa zwischen 50 und 75 Prozent, abhängig vom Schweregrad der
Verbrennung und vom Alter der Betroffenen 13. Bei Patienten, die zusätzlich
ein Lungenversagen (ARDS) erleiden, steigt die Letalitätsrate auf bis zu 90
Prozent 13.
1. 3. Probleme der Antibiotikatherapie
Von einer gezielten Chemotherapie gegen Infektionen wurde erstmals 1630
aus Peru berichtet, wo Eingeborene Malaria erfolgreich mit der Rinde des
Chinabaums behandelten. Den ersten Erfolg im Bereich der antibakteriellen
Therapie schaffte Paul Ehrlich (1854 – 1915) mit der Einführung des
Salvarsans in die Therapie der Syphilis. Den Durchbruch in der Therapie der
bakteriellen Infektionen erzielte der Bakteriologe Alexander Fleming (1881 -
1955) mit der Entdeckung des Penicillins, eines Wirkstoffes, der aus einem
Schimmelpilz gewonnen wird.
Alexander Baraniskin Einführung
11
Die entzündungshemmende Wirkung von Schimmelpilzen war früher schon im
alten Ägypten bekannt. Dort versorgte man Wunden mit verschimmeltem Brot.
Dieses Wissen ging aber im Laufe der Zeit wieder verloren, bis am 5.
September 1928 Alexander Fleming eine erstaunliche Entdeckung machte: in
einer Petrischale, in der er den Schimmelpilz "Penizillium notatum" züchtete,
waren ringsum alle Bakterien abgestorben. Auf diese Weise wurde das
Penicillin entdeckt. Erst 13 Jahre später im Jahre 1941 folgte der erste
dokumentierte Einsatz des Penicillin bei einem Menschen durch den
englischen Arzt Charles Fletcher. Während des zweiten Weltkrieges avancierte
Penicillin schlagartig zum "Wundermittel" bei stark infizierten Verwundungen,
das Tausenden von Soldaten das Leben rettete 39,85. 1935 gelang dem
Biochemiker Gerhard Domagk (1895 – 1964), Professor an der Universität
Münster, ein weiterer Durchbruch. Er fand heraus, dass der orangene
Farbstoff Prontosil wirksam gegen die gefürchteten Streptokokkeninfektionen ist.
Aus dem Farbstoff wurden bald die noch heute eingesetzten Sulfonamide
entwickelt. Die Einführung der Antibiotika revolutionierte die Medizin. Sie
erlaubte sowohl die Behandlung von Infektionen als auch den präventiven
Einsatz dieser Medikamente zur Infektionsprophylaxe 86.
Die Breitbandantibiotika sind in der nachfolgenden Zeit übermäßig und oft
unnötig eingesetzt worden. So wurden in den USA im Jahr 1995 4,1 kg
Antibiotika pro 100 Personen verschrieben 38. Dies führte zur Entstehung und
rasanten Verbreitung multiresistenter Keime. Der Einsatz von
Breitbandantibiotika führt durch das Abtöten aller nicht resistenten Keime zur
Selektion der resistenten, die aufgrund der verringerten intraspezifischen
Konkurrenz verbesserte Wachstumsbedingungen mit vielen Nährstoffen und viel
Raum erhalten.
Alexander Baraniskin Einführung
12
Laut den Daten aus dem National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS)
System Report von 2003 sind der multiresistente Pseudomonas aeruginosa,
der Methicillin - resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und die Vancomycin -
resistenten Enterococci (VRE) die gefährlichsten Erreger von nosokomialen
Infektionen. Mehr als die Hälfte der Staphylococcus aureus - Keime der
Intensivstationen in den USA sind Methicillin – resistent (Tab. II).
Durch den rapiden Anstieg der Resistenzen gegen die klinisch angewandten
Antibiotika (Tab II) sind unsere Chancen, die Verbreitung der multiresistenten
Keime mit Hilfe von Antibiotika einzuschränken, gesunken. So steigt die
Resistenzrate von Staphylococcus aureus gegen Methicillin nach Angaben des
NNIS System Report jährlich um 29 %, von Enterococcus spp gegen
Vancomycin um 31 % und von Pseudomonas aeruginosa gegen Ciprofloxacin
sogar um 53 % (Tab. II).
Auch in den deutschen Kliniken bleiben infizierte Brandwunden trotz
intensivmedizinischer Fortschritte und der Entwicklung neuer Antibiotika ein
ernsthaftes Risiko mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten für den
Schwerverbrannten. Die anzutreffenden Mikroorganismen sind zunehmend
resistent gegen Lokalantibiotika wie z. B. Flammazine, Mafenide oder
Gentamicin, die seit 1960 unverändert in der Klinik eingesetzt werden 70.
Seit 1950 ist der Verbrauch von Penicillin pro therapierte Infektion um das
fünffache gestiegen 4. Durch die rapide Resistenzentwicklung entstehen
zusätzliche gravierende Folgen für die Klinik: aufgrund der Übertragungsgefahr
auf MRSA - negative Patienten müssen MRSA - positive Patienten in isolierte
Einzelzimmer verlegt werden.
Alexander Baraniskin Einführung
13
Dieser Umstand und der durch die multiresistenten Keime verursachte längere
Krankenhausaufenthalt stellen ein immenses sozioökonomisches Problem dar,
verbunden mit einer höheren Patientenmorbidität.
Tabelle II: Anteil der resistenten Keime an den Erregern, die den größten Teil
der Wundinfektionen auf Intensivstationen verursachen, und Anstieg der
Resistenzen innerhalb eines Jahres nach den Daten des NNIS System Report
(USA) vom Juni 2002.
In deutschen Kliniken kostet die Behandlung eines Schwerbrandverletzten
nämlich zwischen 3.500 und 4.500 Euro pro Tag und allein in der
Universitätsklinik Bergmannsheil in Bochum beliefen sich die Kosten für die
Versorgung von Schwerbrandverletzten im Jahr 2003 auf 5,3 Millionen Euro.
Erreger Antibiotikum Anteil der Resistenzen (%)
Resistenzsteigerung innerhalb 2000 (%) (N)
Staphylococcus aureus Methicillin 51,5 29 (5070)
Koagulase-negative
Staphylococci Methicillin 75,5 1 (5622)
Ciprofloxacin, Ofloxacin
36,3 53 (2530) Pseudomonas
aeruginosa Imipenem
19,6
23 (1848)
Enterococcus spp Vancomycin 12,8 31 (2575)
Enterobacter spp Ceftacidim, Ceftriaxon, Cefotaxim
26,3 -1 (1811)
Alexander Baraniskin Einführung
14
Das Center for Disease Control and Prevention in den USA schätzte, dass im
Jahr 2002 in den Vereinigten Staaten rund 5 % aller stationären Patienten an
nosokomialen Infektionen litten, die jährliche Kosten von 4,5 Milliarden Dollar
verursacht haben 78. Die rasche Zunahme und Verbreitung der multi-resistenten
Bakterien und Pilze stellt ein alarmierendes und globales Problem dar, das die
Suche nach alternativen Therapiemöglichkeiten zwingend notwendig macht.
Die Entwicklung neuer Antibiotika scheint in der letzten Zeit zu stagnieren. In
den letzten Jahrzehnten wurden keine neuen Klassen von Antibiotika
eingeführt. So sind beispielsweise neue Dritt- und Viertgenerations-
cephalosporine (z.B. Cefixim, Cefpodoxim, Ceftibuten), Imipenem und neue
Fluorochinolone (z.B. Lomefloxacin, Gatifloxacin) lediglich Derivate älterer
Grundsubstanzen 13. Die Entwicklung neuer Antibiotika ist äußerst
kostenintensiv: 500 Millionen US$ pro erfolgreiches Medikament, und ebenso
zeitaufwendig. 10 – 15 Jahre vergehen in den meisten Fällen bis zur
Zulassung für die Food and Drug Administration (FDA) 79. Für die
Pharmaindustrie bedeutet das hohe Risiken bei den Investitionen 79. Ein
Therapieansatz, der in den letzten Jahren zunehmend verfolgt wird, sind die
Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems.
Alexander Baraniskin Einführung
15
1. 4 Antimikrobielle Peptide
1. 4. 1 Entdeckung der antimikrobiellen Peptide
Auf der Suche nach neuen Technologien macht man sich zunehmend die
Natur zum Vorbild und Ideengeber. Zum Bespiel wurde die Technologie der
Hochhäuser Pflanzen nachempfunden, die der Hubschrauber Insekten. Auch
die medizinische Forschung lässt sich gerne durch Beobachtungen der Natur
inspirieren. Beispielsweise wurde bemerkt, dass Frösche keine Hautinfektionen
bekommen, obwohl sie in einem Milieu leben, das von Bakterien und Pilzen
überfüllt ist. Rinder verletzen sehr oft ihre Zungen durch Äsen scharfer Gräser
und dennoch kommt es niemals zu Infektionen. Angeregt durch diese
Phänomene entdeckte erstmals 1979 Hans Boman aus Stockholm bei der
Seidenraupe natürlich vorkommende Peptide, die antibakterielle Eigenschaften
besaßen. 1987 beobachtete dann Michael Zasloff in den USA, dass
frischoperierte Laborfrösche, die in einen schlammigen Teich gesetzt wurden,
keine Wundinfektionen aufwiesen und keiner Antibiotika zur Wundheilung
bedurften 62. Als man ihnen aber einen Hautlappen entfernte, starben sie
innerhalb von Stunden an einer Wundinfektion. Es lag die Vermutung nahe,
die intakte Haut müsse etwas enthalten, das sie vor Infektionen schützt.
Daraufhin ist es M. Zasloff gelungen, aus Froschhaut ein antimikrobielles
Peptid zu isolieren, das als „Magainin“ (hebräisch: Schutzschild) bezeichnet
wurde 89. Magainin ist auch das erste antimikrobielle Peptid, das in einer
klinischen Studie getestet wurde.
Seitdem wurden mehr als 700 weitere antimikrobielle Peptide aus diversen
Spezies isoliert, z. B. aus Pflanzen, Insekten, Reptilien, Fischen und Säugern.
Alexander Baraniskin Einführung
16
1. 4. 2 Einteilung der antimikrobiellen Peptide
Man kann eine Unterteilung der antimikrobiellen Peptide anhand der Sekundär-
struktur vornehmen. Unterschieden werden soll dabei zwischen Peptiden, die
ausschließlich aus linearen α–Helices aufgebaut sind und solchen, deren
wesentliches Strukturmerkmal die β–Faltblattkonfiguration darstellt.
So besitzen unter anderem die Magainine und das Peptid LL-37 / hCAP-18
eine α - Helixstruktur. LL-37 / hCAP-18 ist ein Peptid mit 37 Aminosäuren, das
erst 1995 charakterisiert wurde und durch die Spaltung des humanen
Cathelicidins entsteht 35. Cathelicidin wurde 1989 erstmals isoliert 60. Beim
Menschen konnte dieses Peptid aus neutrophilen Granulozyten und
Keratinozyten isoliert werden 62.
Im Wesentlichen aus β-Faltblattanordnungen aufgebaut sind dagegen Protegrine
und Defensine. Protegrine sind Peptide mit 18 Aminosäuren, die 1993 aus
Schweineleukozyten isoliert wurden und in vitro eine hohe antimikrobielle
Aktivität zeigten 67,73. Die Defensine, die beim Menschen vorkommen, entdeckte
1995 eine Arbeitsgruppe des Peptidforschungsinstituts in Hannover 62. Sie
bestehen aus 29 bis 40 Aminosäuren und konnten aus neutrophilen
Granulozyten, CD8 T-Lymphozyten, Paneth-Zellen des Dünndarms sowie aus
Epithelien des Urogenital- und des Respirationstraktes isoliert werden 62.
1. 4. 3 Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems
Als essentieller Bestandteil des angeborenen Immunsystems von Vertebraten
besitzen die antimikrobiellen Peptide neben ihrer direkten antimikrobiellen
Funktion auch andere Aufgaben.
Alexander Baraniskin Einführung
17
Eine Funktion der antimikrobiellen Peptide ist die Aktivierung des erworbenen
Immunsystems, wodurch sie als Vertreter der angeborenen Immunabwehr eine
Verknüpfung zwischen den beiden Immunsystemen herstellen 31. LL37 und
humane Defensine locken T-Lymphozyten, reife dendritische Zellen und
Monozyten zum geschädigten Gebiet und stimulieren T-Lymphozyten zur
Freisetzung von inflammatorischen Substanzen wie Interferon–γ, Interleukin-10
(Il-10) und Interleukin-6 (IL-6) 31. Außerdem haben humane Defensine und
LL37 die Eigenschaft Lipopolysaccharid (LPS) zu binden, welches ein
Bestandteil der Zelloberfläche gramnegativer Bakterien ist und als Endotoxin
wirkt 72. Durch diese Bindung wird LPS neutralisiert und die Gefahr des fatalen
septischen Schocks reduziert. 31.
PR-39, ein Cathelizidin aus den neutrophilen Granulozyten des Schweins,
stimuliert die Angiogenese durch eine Verlangsamung der Eliminierung des
Hypoxie-induzierten Faktors (HIF-1α). Dieser Faktor führt wiederum zu einer
erhöhten Expression von angiogenesestimulierenden Faktoren, wie zum Beispiel
des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) 31. Zusätzlich sind die
antimikrobiellen Peptide in der Lage die Wundheilung zu beschleunigen 2.
Bei einer Klasse der antimikrobiellen Peptide wurde auch eine antivirale
Wirkung nachgewiesen: Zhang zeigte in seiner Studie, dass die α-Defensine 1-
3 zur längeren Überlebenszeit von HIV-Infizierten beitragen. Diese Wirkung
wird auf die Blockade von CCR-5 Rezeptoren zurückgeführt, die von HIV-Viren
zum Eintritt in die Zielzellen benutzt werden 92.
Bei Haien scheinen die hochpotenten antimikrobiellen Peptide die Fähigkeit zu
besitzen, entartete Zellen zu zerstören. Dies führt zu einem sehr seltenen
Auftreten von Krebskrankheiten bei diesen Lebewesen 16,29.
Alexander Baraniskin Einführung
18
1. 4. 4 Klinische Studien mit antimikrobiellen Peptiden
Mehrere Abkömmlinge der antimikrobiellen Peptide Magainin und Protegrin-1
werden derzeit in klinischen Studien getestet. In einer bereits abgeschlossenen
Studie zeigte ein Abkömmling des Magainin, Pexiganan, dessen topische
Anwendung an polymikrobiellen diabetischen Ulzera getestet wurde, die gleiche
Wirkung wie das oral applizierte Antibiotikum Ofloxacin, bei fehlenden Neben-
wirkungen (Locilex; Magainin Pharmaceuticals Inc., Plymouth Meeting,
Pennsylvania, USA). Diese Studie wurde jedoch von der Food and Drug
Administration (FDA) nicht zugelassen, weil das orale Antibiotikum bei den
diabetischen Ulzera aufgrund erheblicher Minderperfusion kaum seine Wirkung
entfalten kann.
Protegrine sind Peptide, die im Vergleich zu anderen antimikrobiellen Peptiden
eine hohe antimikrobielle Aktivität zeigen, wobei sie gleichzeitig eine starke
hämolytische Wirkung aufweisen 69,70.
1. 5 Humanes Histon
1. 5. 1. Histonproteine als weitere Effektormoleküle der angeborenen
Immunabwehr
Die Gemeinsamkeit aller antimikrobiellen Peptide ist die positive Ladung. Diese
Eigenschaft ist verantwortlich für die Assoziation der Peptide mit der negativ
geladenen Bakterienmembran und für das darauf folgende Abtöten des
Erregers. Weitere beim Menschen physiologischerweise vorkommende
kationische Proteine sind Histonproteine.
Alexander Baraniskin Einführung
19
In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Histonproteine eine Rolle in
der epithelialen Abwehr spielen und eine weitere Gruppe der Effektormoleküle
der angeborenen Immunabwehr bilden 61. Im Gegensatz zu antimikrobiellen
Peptiden kommen Histonproteine ausnahmslos in jeder eukaryotischen Zelle
vor. Die bisher entdeckten humanen antimikrobiellen Peptide werden nur von
bestimmten Zellarten produziert, und zwar von neutrophilen Granulozyten und
Epithelien der Haut, des Darms, des Urogenital – und des Respirationstraktes
62.
1. 5. 2. Intranukleäre Aufgaben der Histonproteine
Histone sind relativ kleine basische Proteine (21 kDa), die 1946 erstmals von
Stedman E. beschrieben wurden 27. Histonproteine sind ein Bestandteil von
jedem eukaryotischen Zellkern. Sie sind involviert in die hochorganisierte
Struktur der Nukleosomenpartikel, der untersten Organisationsebene des
Chromatins. Die positive Ladung ermöglicht es den Histonen sich fest an die
DNA, die stark negativ geladen ist, zu binden, unabhängig von deren
Nukleotid - Sequenz. Histone dissoziieren nur selten von der DNA, und deshalb
haben sie auf jede Reaktion, die am Chromosom stattfindet, einen Einfluss.
Eine 1,8 – fache DNA – Schleife (146 Basenpaare lang) windet sich um das
Oktamer herum, das aus jeweils zwei Molekülen von jedem der folgenden
Kern – Histone gebildet wird: H2A, H2B, H3 and H4 56,74. Die Verbindung der
Kern - Histone mit der DNA ermöglicht die DNA - Kondensation. Das Histon H1
verschließt gewissermaßen das Nukleosom (Abb. 1) und trägt zusätzlich zur
Kompaktheit der DNA - Organisation bei 9,46.
Alexander Baraniskin Einführung
20
2 2
1
Diese Struktur des Nukleosoms ermöglicht die Chromosomenteilung in der
Meiose und Mitose. Zusätzlich verstärkt sie den Polymorphismus der DNA–
Struktur 10. Mit Ausnahme des Histon H4 sind bei allen Histon-Klassen
mehrere Subgruppen bekannt 1.
Abbildung 1: Ein stark vergrößerter
Ausschnitt der Chromatinstruktur. In dieser
Abbildung sieht man die DNA (1), die um
die Nukleosome (2) gewunden ist. Die Nukleosome
bestehen aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 und sind wiederum
spiralförmig um das Histon H1 (3) organisiert, das in unserer Studie unter-
sucht wurde. Histon H1 verschließt gewissermaßen das Nukleosom.
Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass Histone eine Schlüsselrolle in der
Genregulation spielen. Im euchromatischen Grundzustand sind die Histone
acetyliert. Angelagerte Acetyl - Gruppen, die sauren Charakter haben, verringern
die positive Ladung der basischen Histone, was dazu führt, dass die Faltung
der DNA durch die lockereren Bindungen „aufgeweicht“ wird. Damit wird die
Genexpression erleichtert, da die Transkriptionsenzyme in der lockeren DNA –
Struktur viel leichter ansetzen können.
1 3
3
Alexander Baraniskin Einführung
21
Die Methylierung der Histone lockt hingegen die Deacetylasen an, was zum
Verlust der Acetyl – Gruppen führt, sodass die Histone eine positivere Ladung
erhalten. Die Bindung zwischen Histonen und DNA wird stärker, wodurch die
Genexpression erschwert wird 15,30,34,46,82. Es konnte gezeigt werden, dass
Methyltransferasen zur Tumorsuppression beitragen und ihr Mangel mit einer
erhöhten Tumorinzidenz einhergeht 82. Eine Minderung der Deacetylasen und
eine verstärkte Acetylierung führen zur Kortikosteroidresistenz bei chronisch
entzündlichen Krankheiten und bei COPD 3,40, zur erhöhten Lungenkrebs-
inzidenz und zur Verstärkung der kardialen Remodeling – Prozesse 41,76.
Außerdem erfüllen die Histone für die DNA eine wichtige Schutzfunktion.
Obwohl die DNA außen um die Histone gewickelt ist, wird sie nicht von
Nukleasen abgebaut. DNasen können nur an den Abschnitten zwischen den
Nukleosomen angreifen, die durch die Histone nicht geschützt sind 47,77.
1. 5. 3. Funktionen des Histon H1
Das Histon H1 repräsentiert die am stärksten heterogene Klasse der
Histonproteine. In den somatischen Zellen der Säuger sind bisher sechs
unterschiedliche H1 - Subtypen identifiziert worden, deren Länge zwischen 210
und 230 Aminosäuren beträgt 52. Fünf davon haben eine hochkonservierte
zentrale, globuläre Domäne. Die C- und N- Enden zeigen eine Mikrohetero-
genität, die zur Multifunktionalität dieses Proteins beiträgt 20.
Eine andere intranukleäre Funktion des Histon H1 ist die von Wolffe gezeigte
Regulation der Genexpression 14,20,64,85,89. Es gibt immer mehr Hinweise dafür,
dass Histone zu einer Proteingruppe gehören, die an multiplen biologischen
Prozessen teilnimmt: sowohl an intrazellulären, als auch an extrazellulären.
Alexander Baraniskin Einführung
22
Das rekombinante humane Histon H1° und H1.2 offenbart eine relativ starke
toxische Wirkung gegenüber Zelllinien von entarteten humanen leukämischen
Zellen 12,54. Daraufhin wurde von Class gezeigt, dass das aus dem Rind
isolierte Histon H1 in der Lage war, das Tumorwachstum in vivo zu
supprimieren 12. Beim extrazellulären Histon H1 handelt es sich um ein
Thyreoglobin – bindendes Protein, das an der Oberfläche von Makrophagen zu
finden ist und die Endozytose des Thyreoglobulins vermittelt 9.
An der Zelloberfläche befindliche Histone stellen außerdem ein potentielles Ziel
für die Autoantikörper bei Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes
(SLE) dar 26,32,44,83. Sie sind darüber hinaus in die Pathogenese mehrerer
anderer autoimmuner Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Diabetes mellitus
und rheumatoide Arthritis involviert 36,43,50. Weitere bereits entdeckte Funktionen
des Histon H1 sind die Stabilisierung der Mikrotubuli in den Geißeln von
Seebengeln 44 und der Schutz gegenüber einer Infektion mit dem Parasiten
Leishmania major bei Mäusen 65. Bolton zeigte eine Up - Regulation des
Histonproteins H1 bei Scrapies und bei der Alzheimerschen Krankheit 6.
1. 6. Ziel dieser Studie.
Im Rahmen dieses Forschungsvorhabens wurde das antimikrobielle Potential
des humanen Histonproteins H1.2 in vitro und in vivo charakterisiert. In vitro
wurde die antimikrobielle Aktivität gegen klinisch isolierte Bakterien- und
Pilzstämme getestet. Zusätzlich wurden sowohl die hämolytische als auch die
zytotoxische Wirkung des Histonproteins H1.2 in epithelialen Zellen analysiert.
Für die in vivo Untersuchung wurde ein mit Pseudomonas aeruginosa
infiziertes Rattenverbrennungsmodell verwandt.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
23
2. MATERIAL UND METHODEN
2. 1. Getestete Substanzen
Das humane Histon H1.2, das in den durchgeführten Experimenten verwendet
wurde, stellte uns Strathmann Biotec GmbH, Hamburg, Deutschland
freundlicherweise zur Verfügung. Es wurde rekombinant in Escherichia coli
BL21 (DE3) hergestellt. Aus den Zellüberständen der Bakterien wurde die
Histon H1.2 enthaltende Schicht mittels 0,75 M Perchlorsäure extrahiert und
durch eine 0,45 µm Zellulosemembran (Satorius, Göttingen, Germany) filtriert.
Weitere Purifikation erfolgte mit Hilfe der Umkehrphasen – HPLC (high
performance liquid chromotography). Als stationäre Phase wurde die C18 –
Phase verwendet. Die Kieselpartikelgröße betrug 5 µm. Als mobile Phase
diente 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol. Die Reinheit der Histonfraktion
wurde mit SDS – Page nach Laemmli 33 und mittels der Umkehrphasen – HPLC
mit Vydac 218TP54 bestimmt. Die erreichte Homogenität betrug 98 %.
Histon H1.2 wurde mit dem antimikrobiellen Peptid Protegrin-1 verglichen. Das
verwendete Protegrin-1 wurde bei Dr. Henklein, Charité, Institut für Biochemie
der Humboldt – Universität Berlin, Deutschland synthetisiert. Die Peptidsynthese
wurde nach der Fmoc (9 – fluorenylmethoxycarbonyl) - Methode in Lösung
durchgeführt. Die Purifikation erfolgte mittels der Umkehrphasen – HPLC. Als
stationäre Phase diente die C18 – Phase. Als mobile Phase wurde 0,1 %
Trifluoressigsäure mit Acetonitril verwendet. Die Reinheit wurde mit der
Umkehrphasen – HPLC charakterisiert.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
24
2. 2. Verwendete Mikroorganismen
Elf Bakterienstämme wurden in den in vitro Untersuchungen verwendet. Acht
der Stämme sind ATCC (American Type Culture Collection) - und DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) - gelistet:
Staphylococcus aureus (ATCC 25923; DSMZ 1104); Staphylococcus
epidermidis (ATCC 12228; DSMZ 1798); Enterococcus faecalis (ATCC 29212;
DSMZ 2570;) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853; DSMZ 1117);
Escherichia coli (ATCC 25922; DSMZ 1103); Proteus mirabilis (ATCC 29906;
DSMZ 4479); Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031; DSMZ 681) und
Acinetobacter baumanii (ATCC 19606; DSMZ 30008). Ein klinisches Isolat von
C-MRSA wurde freundlicherweise von Prof. Sören Gatermann, Institut der
Mikrobiologie, Ruhr-Universität, Bochum zur Verfügung gestellt. Drei
Bakterienisolate von Pseudomonas aeruginosa aus menschlichen Brandwunden
erhielten wir von der Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken,
Bergmannsheil, Ruhr-Universität, Bochum. Für das „Infizierte
Rattenverbrennungsmodell“ wurde Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853;
DSMZ 1117) verwendet.
Vier Pilzstämme wurden in dem Radiale – Diffusion - Verfahren eingesetzt:
Candida albicans (ATCC 24433; DSMZ 11948); Candida albicans (ATCC 9928;
DSMZ 11984); Candida parapsilosis (ATCC 22019; DSMZ 5784); und Candida
krusei (ATCC 6258; DSMZ 6128).
Alexander Baraniskin Material und Methoden
25
2. 3. In vitro Untersuchungen
2. 3. 1. Radiale - Diffusion - Verfahren (Radial Diffusion Assay / RDA)
Die Bestimmung der minimalen effektiven Konzentration (MEC) wurde mittels
eines modifizierten zweilagigen Radiale – Diffusion - Verfahrens (RDA) durch-
geführt 67.
Zur Vermehrung der verwendeten Bakterien wurden 100 ml Trypticase Soya
Bouillon (TSB) (Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) mit einer einzelnen
Kolonie des zu verwendeten Bakteriums beimpft und für 18 – 24 Stunden bei
37°C im Wasserbad (B. Braun Melsungen AG, Me lsungen, Deutschland) unter
Schütteln (200 rpm) inkubiert. Daraufhin wurden 500 µl der Kultur mit
Bakterien, die sich in der stationären Phase befanden, mit 50 ml frischem
TSB für 2,5 Stunden bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert.
Die Subkultur wurde in ein 50 ml – Falcon - tube übertragen und für 15 min.
bei 880 x g, bei 4°C zentrifugiert (Megafuge 3OR, Heraeus Instruments GmbH,
Hanau, Deutschland). Das Bakterienpellet wurde danach in kaltem 10 mM
Phosphatpuffer (J.T.Baker, Deventer, Niederlande), pH 7,4 gewaschen (für 15
min. bei 880 x g, bei 4°C) und in 5 ml des gleichen kalten Puffers
resuspendiert. Daraus wurde 1 ml entnommen, um über die Messung der
optischen Dichte (UV – V – IS - Spektrometer, Perkin Elmer 555, Boston,
Massachusetts, USA) (OD) bei 620 nm die Konzentration der Bakterien oder
Pilze mit folgender Gleichung zu ermitteln:
Alexander Baraniskin Material und Methoden
26
Colony forming Units / ml = OD620nm x 2,5 x 108 (Bakterien)
Colony forming Units / ml = OD620nm x 0,5 x 108 (Pilze)
(Um die Bakterienkonzentration in einem definierten Probenvolumen zu
quantifizieren setzt man die Anzahl der nach der Inkubation entstandenen
Kolonien: CFU = colony forming units bzw. KBE = koloniebildende Einheiten in
Verhältnis zum ausgeimpften Probevolumen (ml) : Colony forming unit / ml)
Aus der errechneten Konzentration konnte das Volumen ermittelt werden, das
2 x 107 CFU Bakterien oder Pilze enthält und das mit dem Unterlage - Agar
für eine Platte gemischt wurde. Der sterile, geschmolzene Unterlage – Agar
besteht aus 1 % (w / v) Agarose (Agarose NEEO Ultra-Qualität, Carl Roth
GmbH, Karlsruhe, Deutschland). Fünfzehn ml Unterlage – Agar, der auf 45 -
50°C vorgewärmt wurde, wurden in ein Falcon - tube gegeben, mit 2 x 107
CFU Bakterien oder Pilzen beimpft und 15 s gemischt. Danach wurde das
Gemisch vom Unterlage – Agar mit der Bakterien – oder Pilzsuspension in einer
Petrischale (9 x 9 cm) (Greiner-Bio-one, Kremsmünster, Österreich) auf einem
Nivelliertisch gleichmäßig verteilt (1,3 mm Schicht) (Abb. 2). Die Schale wurde
für 30 min. bei 4°C kaltgestellt, damit der Agar sich verfestigt.
Anschließend wurden mit einem Stempel neun (3 x 3) Löcher in den Agar
gestanzt. Die Löcher hatten einen Durchmesser von 3 mm und eine Kapazität
von ungefähr 8 µl. In diese Vertiefungen wurden 5 µl der vorbereiteten
verdünnten Peptidlösung gefüllt. Die gereinigten Peptide wurden mit einer 0,01 %
Essigsäure (J.T.Baker, Deventer, Niederlande) zu folgenden Konzentrationen
seriell verdünnt: 250 µg / ml, 79,1 µg / ml, 25 µg / ml, 7,91 µg / ml, 2,5 µg / ml,
0,791 µg / ml und 0,25 µg / ml.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
27
Sieben der neun Vertiefungen wurden mit den sieben Peptidkonzentrationen
gefüllt, eine Vertiefung mit einem gegen die entsprechenden Erreger
eingesetzten Antibiotikum bzw. Antimykotikum als Positivkontrolle und eine mit
der 0,01 % Essigsäure als Negativkontrolle. Die Antibiotika wurden in
folgenden Konzentrationen verwendet: Ampicillin (Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
Deutschland) in 2 mg / ml; Vancomycin (Eli Lilly Company, Indianapolis,
Indiana, USA) in 6 ml / ml; Imipenem (Merck&Co KGaA, Darmstadt,
Deutschland) in 2 mg / ml und das Antimykotikum Amphotericin B (Carl Roth
GmbH, Karlsruhe, Deutschland) in der Konzentration von 2 mg / ml (Abb. 2).
Abbildung 2: Radiale – Diffusion – Verfahren – Testplatte von E. coli bei der
Histon H1.2 – Testung: 1 – 250 µg / ml, 2 - 79,1 µg / ml; 3 – 2 µg / ml; 4 - 7,91 µg /
ml; 5 - 2,5 µg / ml; 6 - 0,791 µg / ml; 7 - 0,25 µg / ml; S - 0,01 % Essigsäure
(Negativkontrolle); A – Ampicillin (Positivkontrolle).
Alexander Baraniskin Material und Methoden
28
Die Platten wurden für 3 Stunden bei 37°C i nkubiert. Danach wurde der
vorgewärmte sterile Auflage – Agar (10 ml) darübergegossen und gleichmäßig
verteilt. Der nährstoffreichere Overlay – Agar besteht aus 6 % Trypticase Soya
Bouillon Pulver, 1 % Agarose und 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.4).
Nach Verfestigung des Agars wurden die Petrischalen bei 37°C über 16 – 18
Stunden inkubiert (Heraeus, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland).
Am nächsten Tag wurden die entstandenen Hemmhöfe mit Hilfe eines
Millimeter – Lineals mit einer Genauigkeit bis auf 0,1 mm ausgemessen.
Danach wurden 3 mm als Durchmesser der gestempelten Löcher vom
Durchmesser der entstandenen Hemmhöfe subtrahiert (Abb. 2). Die Ergebnisse
wurden an einer semi - logarithmischen Skala dargestellt und mit Hilfe der
linearen Regressionsanalyse die Schnittpunkte mit der X – Achse ermittelt.
Diese Schnittpunkte entsprechen der minimalen effektiven Konzentration (MEC).
Alle Bestimmungen wurden als Triplikate durchgeführt.
2. 3. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs - Verfahren
Die Bestimmung der minimalen inhibitorischen (MIC) und bakteriziden
Konzentration (MBC) wurde mittels Modifiziertem NCCLS (National Committee
for Clinical standards) Mikrobouillon – Verdünnungs - Verfahren durchgeführt
(Modified Microbroth dilution Assay) 65.
Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des
National Committee for Clinical standards (NCCLS) ausgeführt. Die einzige
vorgenommene Veränderung ist der Ersatz von Trypticase - Soya - Bouillon
durch Müller - Hinton - Bouillon (Merck GmbH, Hohenbrunn, Deutschland) bei
der Vorbereitung des Bakterieninokulates.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
29
Zur Vermehrung der verwendeten Bakterien wurde eine einzelne Kolonie des
zu verwendeten Bakteriums in 50 ml Müller – Hinton – Bouillon für 18 - 24
Stunden bei 37°C im Wasserbad (B. Braun Melsu ngen, Melsungen
Deutschland) schüttelnd (200 rpm) inkubiert. Daraufhin wurde eine 1 : 20
Verdünnung der Kultur in 1 ml frischen Müller - Hinton – Bouillon durchgeführt.
Es folgte die Messung der optischen Dichte (UV – V – IS - Spektrometer, Perkin
Elmer 555, Boston, Massachusetts, USA) bei 600 nm. Die benötigte Menge
der Bakteriensuspension wurde folgendermaßen errechnet:
OD600nm x n CFUs 7ml / 0,2 = Colony forming Unit / ml
(CFU / ml x 20 CFUs / ml) / (4 x 105 CFU / ml) = Verdünnungsfaktor
Für eine 96 Well Mikrotiterplatte benötigt man 10 ml der Bakteriensuspension
mit 4 x 105 CFU / ml. Die zu testenden Substanzen Histon H1.2, Protegrin-1
und die Antibiotika wurden mit einer Peptidverdünnungslösung verdünnt. Diese
Lösung enthält 0,01 % Essigsäure (J.T.Baker, Deventer, Niederlande) und 0,1 %
humanes Serumalbumin (Fraktion V, SERVA Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, Deutschland). Danach folgte eine serielle 1 : 2 Verdünnungsreihe
von der höchsten Konzentration von 1000 µg / ml bis zur niedrigsten von 1
µg / ml, d.h. insgesamt 11 unterschiedliche Konzentrationen. In jeweils drei
Reihen der 96 well Polypropylen - Mikrotiterplatte (Ushape, Greiner, Solingen,
Deutschland) wurden 100 µl der Bakteriensuspension mit 4 x 105 CFU / ml
vorgelegt (Abb. 3). Aus der Peptidverdünnungsreihe wurden dann mittels
Mehrkanalpipette jeweils 11 µl der Peptidverdünnungen in jedes Well mit
Bakteriensuspension überführt. In die drei Wells, die als Negativkontrolle
galten, wurde keine Peptidlösung verteilt.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
30
Anschließend wurden die Miktrotiterplatten über 16 – 18 Stunden bei 37°C
inkubiert (Heraeus, Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland). Am nächsten Tag
konnte die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) durch die Feststellung
des letzten Wells in der Reihe ohne sichtbares Wachstum ermittelt werden.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Abbildung 3: Mikrobouillon - Verdünnungs - Verfahren – Mikrotiterplatte zur
Ermittlung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC) des Histon H1.2
gegen MRSA: 1 - 100 µg / ml, 2 – 50 µg / ml; 3 – 25 µg / ml; 4 – 12,5 µg / ml; 5
– 6,25 µg/ml; 6 – 3,125 µg / ml; 7 – 1,6 µg / ml; 8 – 0,8 µg / ml; 9 – 0,4 µg / ml;
10 – 0,2 µg / ml; 11 – 0,1 µg / ml; 12 – Negativkontrolle.
Um die minimale bakterizide Konzentration (MBC) zu ermitteln, wurden 200 µl
Trypticase Soya Bouillon (Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) auf einer
Mikrotiterplatte vorgelegt. Danach erfolgte die Zugabe von je 10 µl aus den
getesteten MIC - Wells, 2 x MIC – Wells und 4 x MIC – Wells (Abb. 3). Die
Mikrotiterplatte wurde nochmals über 16 – 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Am
nächsten Tag entsprachen die Wells mit höchsten Peptidkonzentrationen der
jeweiligen Reihe und ohne sichtbares Wachstum der minimalen bakteriziden
Konzentration (MBC). Das Modifizierte NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs –
Verfahren wurde nur mit Bakterien durchgeführt. Alle Bestimmungen wurden
als Triplikate durchgeführt.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
31
2. 3. 3. Hämolytische Aktivität des Histon H1.2
Vollblut wurde aus der Armvene einer freiwilligen Probandin mittels EDTA -
Röhrchen entnommen. Durch Zentrifugation (Megafuge 3OR, Heraeus
Instruments GmbH, Hanau, Deutschland) erfolgte eine sofortige Trennung von
Erythrozyten und Plasma. Im Anschluss wurden mehrere Waschschritte mit
isotonischer 0,9 % Kochsalzlösung (Delta-Pharma GmbH, Pfullingen,
Deutschland) durchgeführt, bis der Überstand keine Färbung mehr aufwies. Für
die Messung wurde eine 2,8 %ige (v / v) Erythrozyten – Suspension in
Phosphat gepuffte Kochsalzlösung (PBS) (PAA Laboratories GmbH, Linz,
Österreich) hergestellt.
Alle verwendeten Substanzen wurden in Phosphat gepuffter Kochsalzlösung
gelöst. Es wurden folgende Konzentrationen verwendet: 250 µg / 100 µl, 79,1 µg
/ 100 µl, 25 µg / 100 µl, 7,91 µg / 100 µl, 2,5 µg / 100 µl, 0,79 µg / 100 µl und
0,25 µg / 100 µl. Die 2,8 % Erythrozyten – Suspension wurde mit den
verschiedenen Testsubstanzen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert (Heraeus,
Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland).
Als Negativ – Kontrolle diente Phosphat gepuffte Kochsalzlösung anstelle der
Testsubstanz. Für die Positiv – Kontrolle wurde die Erythrozyten - Suspension
mit 0,1 % Triton – X – 100 - Lösung behandelt. Nach Zentrifugation erfolgte die
photometrische Messung der Überstände bei 540 nm mittels eines ELISA -
Platereaders.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
32
Zur Berechnung der hämolytischen Aktivität diente folgende Gleichung:
Hämolytische Aktivität in % = ((ExtProbe – Extneg-Ko.) / (Extpos-Ko. – Extneg-Ko )) x 100
ExtProbe = Extinktion der behandelten Zellen
Extneg-Ko = Extinktion der unbehandelten Zellen
Extpos-Ko = Extinktion der mit Triton – X - 100 behandelten Zellen
Alle Bestimmungen wurden als Triplikate durchgeführt.
2. 3. 4. Zytotoxische Aktivität des Histon H1.2
Um den zytotoxischen Effekt vom humanen antimikrobiellen Peptid LL37 zu
untersuchen, wurden primäre humane Keratinozyten isoliert und die BrdU
Zellproliferation ELISA mit biolumineszentem Detectionssystem (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt.
Man überführte primäre humane Keratinozyten in eine 96 – Well Mikrotiterplatte
(Ushape, Greiner, Solingen, Deutschland) mit einer Dichte von 85.000 Zellen /
cm2 und inkubierte sie für 24 Stunden bei 37°C mit 5 % CO2 - Gehalt in
einer befeuchteten Atmosphäre. Anschließend folgte die Inkubation der
primären humanen Keratinozyten für 6 h, 12 h oder 24 h mit
unterschiedlichen Konzentrationen des Histon H1.2 in einem serumfreien
Medium. Folgende Histon H1.2 - Konzentrationen wurden getestet: 250 µg / ml,
79,1 µg / ml, 25 µg / ml, 7,91 µg / ml, 2,5 µg / ml, 0,791 µg / ml und 0,25 µg /
ml. Jeder einzelne Arbeitsschritt wurde entsprechend den Herstellungs-
anweisungen durchgeführt. Die Biolumineszenz wurde nach der automatischen
Injektion der Substratlösung mir einem Mikroplatten – Luminometer gemessen
(Orion, Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland).
Alexander Baraniskin Material und Methoden
33
2. 4. In vivo Untersuchung: Infiziertes Rattenverbren nungsmodell
Um die antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vivo zu untersuchen, wurde
im infizierten Rattenverbrennungsmodell eine Vergleichsstudie zwischen dem
Histon H1.2, Protegrin-1 als Positivkontrolle und Phosphat gepuffte
Kochsalzlösung (PBS) als Trägerkontrolle durchgeführt.
Das unten beschriebene Versuchsprotokoll entsprach den Vorgaben, die in
dem „Leitfaden zur Pflege und Nutzung der Labortiere“ des
Bundestierschutzgesetzes niedergelegt sind (Tierantrag: Nr. 102/6; Aktenzeichen
508735.1; Bezirksregierung Arnsberg). Die Tiere für das in unserer
Arbeitsgruppe etablierte Rattenverbrennungsmodell wurden in der
Labortieranlage der Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken,
Bergmannsheil, Ruhr-Universität, Bochum untergebracht 68. Der Gesamtversuch
wurde in zwei Versuchsgruppen zu je 17 Tieren (15 + 2 Ausgleich)
randomisiert. Die Sprague Dawley Ratten (Charles - River, Sulzfeld,
Deutschland) wurden zwei Wochen vor Versuchsbeginn eingestallt und täglich
kontrolliert. Die Tiere befanden sich stets in einem 12 Stunden währenden
Tag – Nacht Rhythmus und wurden bei konstanter Temperatur von 22°C und
Luftfeuchte von 65 % gehalten. Das Körpergewicht der Tiere lag zu
Versuchsbeginn zwischen 220 und 260 g.
Vierundzwanzig Stunden vor der Verbrennung wurde in LB - Medium (IDGLPC,
Lancashire, Großbritannien) eine 3 ml Übernachtschüttelkultur von
Pseudomonas aeruginosa angeimpft und bei 37°C, im Wasserbad (B. Br aun
Melsungen, Melsungen, Deutschland) schüttelnd (250 rpm) inkubiert. Die
Übernachtschüttelkultur wurde auf 45 ml LB - Medium überimpft und für weitere
2,5 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
34
Anschließend wurden die Bakterien für 5 Minuten bei 4000 rpm und 20°C
zentrifugiert (Megafuge 1.0R, Haereus, Hanau, Deutschland).
Das Bakterienpellet wurde in einem adäquaten Volumen Dulbecco’s Phosphat
gepuffte Kochsalzlösung (PBS), (PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich)
resuspendiert und die OD600nm im BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg,
Deutschland) bestimmt. Die Bakterienanzahl pro Volumeneinheit wurde in CFU
(colony forming units) pro ml Medium über die folgende Gleichung berechnet:
Colony forming Unit / ml = OD600nm x 2,5 x 108 (Bakterien)
Diese Bakteriensuspension wurde mit Phosphat gepuffter Kochsalzlösung (PBS)
verdünnt, so dass sich die benötigte Menge (1 x 108 ) Bakterien in 250 µl
Medium befand. Die Tiere wurden vor Versuchsbeginn gewogen, um die
benötigte Menge an Anästhetika gemäß dem Standardprotokoll mit 100 mg / kg
Körpergewicht Ketamin (Ketamin ratiopharm ®, Ratiopharm, Ulm, Deutschland)
und 20 mg / kg Körpergewicht Xylazin (Rompun ®, Bayer, Leverkusen,
Deutschland) zu berechnen. Die Anästhetika wurden in 0,9 % isotonischer
Kochsalzlösung (Delta-Pharma, Pfullingen, Deutschland) verdünnt. Die
entsprechende Narkosemenge wurde den Tieren intraperitoneal appliziert.
Anschließend wurde das Rückenfell auf 0,1 mm gekürzt. Das rasierte Areal
wurde mit Enthaarungscreme (Veet, Reckitt Benckiser, Mannheim, Deutschland)
eingerieben. Nach 10 Minuten Einwirkzeit wurden die Tiere unter fließendem
warmen Wasser enthaart und gewaschen.
Vierundzwanzig Stunden nach der Enthaarung wurden die Tiere in Narkose
versetzt.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
35
Dreißig Minuten vor Versuchsbeginn wurde jedem Tier 0,04 ml (2 units)
Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic ®, Essex Pharma, München, Deutschland)
subkutan appliziert.
Die folgende Narkose erfolgte in gleicher Form wie am Tag zuvor, und zwar
intraperitoneal mit 100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 20 mg / kg
Körpergewicht Xylazin. Der Rücken der Tiere wurde mit einem wasserfesten
Stift in Quadranten unterteilt, um bei jedem Tier ein vergleichbares Hautareal
zu verbrennen. Die Tiere wurden anschließend in einem vorbereiteten
Isolierschlauch eingeschlossen, der lediglich die zu verbrühenden Hautareale
aussparte (Abb. 4). Jedes Tier wurde beidseitig für 20 Sekunden in 60°C
heißem Wasser verbrüht (Abb. 5). Nach der Verbrühung wurden die beiden
Areale sofort abgetrocknet, markiert und mit Softasept ® (B. Braun Melsungen,
Melsungen, Deutschland) ausgiebig desinfiziert (Abb. 6). Nachdem das
Desinfektionsmittel abgetrocknet war, wurden die verbrannten Areale mit einer
sterilen Gaze (Johnson & Johnson, Gargrave, UK) bedeckt und mit 250 µl
Pseudomonas aeruginosa – Suspension benetzt (topische Applikation), um die
Infektion zu etablieren (Abb. 7). Um eine Kreuzkontaminierung zu vermeiden
und die Wachstumsbedingungen für die Bakterien zu verbessern, wurde
unmittelbar nach der Applikation der gesamte Rückenbereich mit dem Verband
Tegaderm ® (6 x 7 cm, 3M Health Care, Borken, Deutschland) und mit Peha –
haft ® (Hartmann, Heidenheim, Deutschland) okklusiv verbunden. Um die
Stabilität zu verstärken und einen mechanischen Schutz zu gewährleisten,
wurde zusätzlich viermal mit Klammern fixiert (Visistat ®, Weck Closure
Systems, Raleigh, North Carolina, USA). Im weiteren Verlauf wurde den Tieren
alle 12 Stunden 0,04 ml (2 units) Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic ®, Essex
Pharma, München, Deutschland) subkutan appliziert.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
36
Abb. 4: Das Versuchstier im Isolierschlauch, der lediglich die zu verbrühenden
Hautareale ausspart.
Abb. 5: Das Hautareal unmittelbar nach der Verbrühung.
Abb. 6: Nach der Verbrühung wurden die beiden Areale für die P.aeruginosa-
Suspension markiert.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
37
Abb. 7: Applikation der Bakteriensuspension auf die Wundgaze, um die
Infektion zu etablieren.
Abb. 8: Setzen der 1,5 x 1,5 cm Markierung – linke Bildhälfte, welche das
Areal für die Applikation anzeigt und die intradermale Applikation der
antimikrobiellen Peptide – rechte Bildhälfte.
Zwei Tage nach der Infektion wurde den Ratten die Testsubstanz Histon H1.2
appliziert. Jedem Tier wurde 30 Minuten vor Versuchsbeginn 0,04 ml (2 units)
Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic ®, Essex Pharma, München, Deutschland)
subkutan appliziert. Die folgende Narkose erfolgte in gleicher Form wie vor
der Enthaarung: intraperitoneal mit 100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 20
mg / kg Körpergewicht Xylazin.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
38
Die Tiere wurden einzeln narkotisiert, um einen reibungslosen Ablauf zu
gewährleisten.
Es wurde bei jedem Tier je Flanke innerhalb des verbrannten Areals ein 1,5
x 1,5 cm großes Areal eingezeichnet, in welches die Applikation der
vorbereiteten Lösungen erfolgte (Abb. 8). Folgende Lösungen wurden
verabreicht: die Теstsubstanz Histon H1.2 in drei unterschiedlichen
Konzentrationen: 25 µg / ml, 250 µg / ml und 2500 µg / ml (gelöst in Phosphat
gepuffter Kochsalzlösung), Protegrin-1 in 250 µg / ml als Positivkontrolle und
Phosphat gepuffte Kochsalzlösung (PBS) als Trägerkontrolle. Je Areal wurden
250 µl der entsprechenden Lösung intradermal und weitere 250 µl der
gleichen Lösung topisch auf eine sterile Gaze (Johnson & Johnson, Gargrave,
Großbritannien) appliziert (Abb. 8). Unmittelbar nach erfolgter Applikation wurde
der Wundbereich mit Tegaderm ® (6 x 7 cm, 3M Health Care, Borken,
Deutschland) okklusiv verbunden, welcher dann zum Schutz mit Peha – haft ®
(Hartmann, Heidenheim, Deutschland) umwickelt und viermal mit Klammern
(Visistat ®, Weck Closure Systems, North Carolina, USA) fixiert wurde.
Nach 4 Stunden wurden die Tiere in zeitlicher Reihenfolge der Applikation
durch die intraperitoneale Gabe einer Lethaldosis von 1 ml Pentobarbital –
Natrium (Narcoren ®, Fa. Merial GmbH, Athen, Georgia, USA) getötet.
Dasjenige Hautareal, in das die Applikation erfolgte, wurde entnommen und in
ein 12 ml Flachbodenröhrchen (TPP, OmniLab AG, Berlin, Deutschland)
überführt, gewogen und bis zur Homogenisation bei 4°C auf Eis gehalten. Die
Hautareale wurden in 3 ml Phosphat gepuffter Kochsalzlösung mittels Polytron®
PT3100 (Kinematika, Luzern, Schweiz) bei 26.000 rpm unter Kühlung
homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenisat seriell (1 : 10; 1 : 100 und
1 : 1000) verdünnt.
Alexander Baraniskin Material und Methoden
39
Die Verdünnungen wurden daraufhin in Triplikaten auf Pseudomonas
Isolationsagarplatten (Beckton Dickinson, Cockeysville, Maryland, USA), sowie
in einfacher Ausführung auf Mueller – Hinton Agar mit 5% Schafsblut (Becton
Dickinson, Heidelberg, Germany) ausplattiert. Die Platten wurden für 18
Stunden bei 37°C inkubiert (Heraeus, Heraeus Holding GmbH, Hanau,
Deutschland).
Anschließend wurden die Platten quantitativ und qualitativ ausgewertet: Die
gezählten Kolonien pro Platte dienten der Bestimmung der CFU pro
Gesamtprobe, indem sie mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor
multipliziert wurden. Diese Gesamtbakterienzahl wurde zu den Gramm
entnommenen Gewebes in Bezug gesetzt und womit der Endwert in CFU / g
Gewebe ermittelt werden konnte.
2. 5. Statistische Analyse
Die Ergebnisse des Radiale – Diffusion - Verfahrens, des Modifizierten NCCLS
Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahrens und der Untersuchung der
hämolytischen Aktivität wurden mit dem Programm Stat - View (SAS Institute,
Cary, North Carolina, USA) ausgewertet. Die Daten des infizierten
Rattenverbrennungsmodells wurden mit dem Programm SPSS (SPSS Inc.,
Chicago, Illinois, USA) bearbeitet. Die Ergebnisse wurden bei p < 0,05 als
signifikant gewertet.
Alexander Baraniskin Ergebnisse
40
3. ERGEBNISSE
3. 1. In vitro Aktivität von Histon H1.2
3. 1. 1. Radiale – Diffusion – Verfahren
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die antibakterielle und die
antimykotische Aktivität des Histon H1.2 gegen unterschiedliche
Mikroorganismen zu beurteilen, die für die meisten Infektionen der humanen
Brandwunden verantwortlich sind. Die Ergebnisse wurden mit dem natürlich
vorkommenden antimikrobiellen Peptid Protegrin-1 68,70 und mit den klinisch
angewandten Antibiotika und Antimykotika verglichen. Folgende Antibiotika
wurden verwendet: Imipenem wurde gegen Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii und Proteus mirabilis eingesetzt.
Gegen drei bakterielle Isolate (Pseudomonas aeruginosa) von verbrannten
Patienten wurde ebenfalls Imipenem benutzt. Ampicillin wurde gegen
Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis eingesetzt,
und Vancomycin gegen Staphylococcus epidermidis und C-MRSA. Als
Antimykotikum gegen Candida albicans 246, Candida albicans 248, Candida
parapsilosis und Candida crusei wurde Amphotericin B verwendet.
3. 1. 1. 1. Grampositive Bakterien
Gegen die besonders relevanten Erreger der humanen Brandwunden-
infektionen, Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis offenbarte
Histon H1.2 eine höhere antibakterielle Aktivität als die entsprechenden klinisch
angewandten Antibiotika:
Alexander Baraniskin Ergebnisse
41
Minimale effektive Konzentration (MEC) des Histon H1.2 3,178 µg / ml und
3,14 µg / ml versus minimale effektive Konzentration des Ampicillin 10,507 µg /
ml und 28,853 µg / ml (p <0,0001) (Abb. 9).
Verglichen mit Protegrin-1 zeigte Histon H1.2 gegen Staphylococcus
epidermidis und Enterococcus faecalis eine signifikant höhere Aktivität oder
eine niedrigere MEC; minimale effektive Konzentration des Histon H1.2 3,123
µg / ml und 3,14 µg / ml vs. minimale effektive Konzentration des Protegrin-1
4,48 µg / ml und 4,46 µg / ml (p < 0,005) (Abb. 9).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
S.aureus S.epidermidis E.faecalis MRSA
ME
C (
µg/m
l)
Histon 1.2
Protegrin 1
Antibiotikum
Abbildung 9: Radiale – Diffusion – Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen
Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit den klinisch angewendeten
Antibiotika gegen grampositive Bakterien. Es wurde die minimale effektive
Konzentration (MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2 versus Antibiotikum;
#,P < 0.05, Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05, Protegrin-1 versus
Antibiotikum.
* +
#* #* +
Alexander Baraniskin Ergebnisse
42
3. 1. 1. 2. Gramnegative Bakterien
Die antibakterielle Aktivität des Histon H1.2 gegen Escherichia coli und
Klebsiella pneumoniae ist zwar niedriger als die Aktivität des Protegrin-1, sie
ist jedoch wesentlich höher als die antibakterielle Aktivität der entsprechenden
angewandten Antibiotika (Abb. 10). Außerdem wies Histon H1.2 eine
vergleichbare minimale effektive Konzentration gegen alle getesteten
gramnegativen Bakterien und gegen die bakteriellen Isolate auf (Abb. 11).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
E.coli P.auroginosa A.baumanii K.pneumoniae P.mirabilis
ME
C (
µg/m
l)
Histon 1.2
Protegrin 1
Antibiotikum
Abbildung 10: Radiale - Diffusion - Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen
Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit den derzeit klinisch
angewendeten Antibiotika gegen gramnegative Bakterien. Es wurde die
minimale effektive Konzentration (MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2
versus Antibiotikum; #,P < 0.05, Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05,
Protegrin-1 versus Antibiotikum.
#* #* * * *
+
+ +
+
+
Alexander Baraniskin Ergebnisse
43
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Isolate 1 Isolate 2 Isolate 3
ME
C (µ
g/m
l)Histon 1.2
Protegrin 1
Imipenem
Abbildung 11: Radiale - Diffusion - Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen
Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit den derzeit klinisch
angewendeten Antibiotika gegen drei Bakterienisolate (Pseudomonas
aeruginosa) von verbrannten Patienten. Es wurde die minimale effektive
Konzentration (MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2 versus Antibiotikum;
#,P < 0.05, Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05, Protegrin-1 versus
Antibiotikum.
3. 1. 1. 3. Pilze
Die antimykotischen Eigenschaften des Histon H1.2 zeigten ähnliche Resultate
wie die des Protegrin-1 und eine stärkere Aktivität gegen alle getesteten Pilze
als das verwendete Antimykotikum Amphotericin B (Abb. 12).
+ +
+
#*
#*
*
Alexander Baraniskin Ergebnisse
44
0
5
10
15
20
25
30
35
40
C.albic. 24433 C.albic.9928 C.parapsylosis C.krusei
ME
C (µ
g/m
l)Histon 1.2
Protegrin 1
Amphotericin B
Abbildung 12: Radiale – Diffusion - Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen
Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit dem klinisch angewendeten
Antimykotikum Amphotericin B gegen verschiedene Pilzstämme, die
Wundinfektionen verursachen. Es wurde die minimale effektive Konzentration
(MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2 versus Antimykotikum; #,P < 0.05,
Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05, Protegrin-1 versus Antimykotikum.
Ferner ist besonders hervorzuheben, dass Histon H1.2 annähernd eine
identische antibakterielle Aktivität sowohl gegen die grampositiven, wie auch
gegen die gramnegativen Bakterien, gegen die bakteriellen Isolate und sogar
gegen die getesteten Pilzstämme zeigte.
* #* #* +
+ +
Alexander Baraniskin Ergebnisse
45
3. 1. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren
Das Modifizierte NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren wurde gemäß
den Leitlinien der National Committee for Clinical Standards 67 durchgeführt.
Die antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 wurde, abgesehen von den drei
Pilzstämmen, gegen die gleichen Mikroorganismen untersucht, die mit dem
Radiale - Diffusion - Verfahren getestet wurden. Die Ergebnisse, die das
Modifizierte NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren ergab, korrelieren
mit den Ergebnissen des Radiale - Diffusion - Verfahrens und bestätigen somit
diese.
Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) des Protegrin-1 gegen Proteus
mirabilis und die minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBC) gegen
Enterococcus faecalis, Acinetobacter baumanii, Proteus mirabilis und zwei von
den drei getesteten bakteriellen Isolaten konnten mit den höchsten
angewandten Konzentrationen nicht ermittelt werden. Im Gegensatz hierzu fallen
die minimalen inhibitorischen Konzentrationen und die minimalen bakteriziden
Konzentrationen des Histon H1.2 gegen die grampositiven Bakterien durch
konstante Werte auf: MIC 12,5 µg / ml und MBC 50 µg / ml (Tabelle III).
Ähnliche Ergebnisse wies Histon H1.2 gegen die gramnegativen Bakterien und
gegen die Bakterienisolate aus menschlichen Brandwunden auf. Die
Untersuchungen ergaben eine konstante minimale bakterizide Konzentration
(100 µg / ml). Die minimale inhibitorische Konzentration variierte zwischen 25
µg / ml und 100 µg / ml (Tabelle III).
Alexander Baraniskin Ergebnisse
46
Tabelle III: Die Ergebnisse des Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Ver-
dünnungs – Verfahren. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) und
die entsprechenden minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBC) des Histon
H1.2 sind aufgeführt.
Bakterien S.aureus S.epidermidis E.faecalis MRSA E.coli P.aeruginosa A.baumanii K.pneumoniae P.mirabilis Isolate 1a Isolate 2a Isolate 3a
MIC (µg/ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 25 50 25 50 25 100 50 50
MBC (µg/ml)
50 50 50 50 100 100 100 100 100 100 100 100
a drei Bakterienisolate (Pseudomonas aeruginosa) von Schwerbrandverletzten
3. 1. 3. Hämolytische Aktivität
Die hämolytische Aktivität wurde durch die Aussetzung einer 2,8 % Suspension
der gewaschenen humanen Erythrozyten zu Peptiden in unterschiedlichen
Konzentrationen bestimmt. Es wurden die gleichen Konzentrationen wie im
Radiale - Diffusion - Verfahren eingesetzt.
Folgende Substanzen wurden untersucht: Histon H1.2, Protegrin–1 und die
klinisch angewendeten Antibiotika, die in den beiden in vitro Experimenten
benutzt wurden: Ampicillin, Imipenem und Vancomycin.
Alexander Baraniskin Ergebnisse
47
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Peptidkonzentration (µg/100µl)
Häm
olyt
isch
e A
ktiv
ität (
%)
Protegrin-1
Vancomycin
Imipenem
Histon H1.2
Ampicillin
Abbildung 13: Hämolytische Aktivität. Eine 2.8 % - Suspension der
gewaschenen humanen Erythrozyten wurde mit verschiedenen seriell
verdünnten Peptiden für 30 min bei 37°C inku biert. Die untersuchten
Substanzen waren Histone H1.2, Protegrin-1 und klinisch angewendete Anti-
biotika, die in den beiden in vitro Untersuchungen benutzt wurden: Ampicillin,
Imipenem und Vancomycin.
Alexander Baraniskin Ergebnisse
48
Das Histon H1.2 weist fast gleich niedrige hämolytischen Eigenschaften wie
die drei getesteten klinisch zugelassenen Antibiotika auf (Abb. 13). Sogar aus
einer Erhöhung der Konzentration des Histon H1.2 bis auf 250 µg / ml
resultierte kein wesentlicher Anstieg der hämolytischen Aktivität: die hämo-
lytische Aktivität bei Histon H1.2 – Konzentration von 0,25 µg / ml betrug 1 %.
Bei der Konzentration von 250 µg / ml betrug die hämolytische Aktivität nur
2 %. Dieser sehr geringe konzentrationsabhängige Anstieg der hämolytischen
Wirkung des Histon H1.2 stimmt auch mit den hämolytischen Eigenschaften
der zugelassenen Antibiotika überein. Verglichen mit Histon H1.2 übte das
Peptid Protegrin-1 einen starken hämolytischen Effekt aus, der bereits bei der
Peptidkonzentration von 7,91 µg / ml 64 % betrug und bei 79,1 µg / ml bis auf
100 % anstieg. Die hämolytische Aktivität des Histon H1.2 liegt durchschnittlich
bei 2 % und ist nahezu konzentrationsunabhängig (Abb. 13).
3. 1. 4. Zytotoxische Aktivität
Die zytotoxischen Untersuchungen wurden an isolierten primären humanen
Keratinozyten durchgeführt. Diese Zellen wurden mit unterschiedlichen
Konzentrationen des Histon H1.2 inkubiert. Es wurden die gleichen
Konzentrationen eingesetzt, wie im Radiale - Diffusion - Verfahren. Die
zytotoxischen Aktivitäten des Histon H1.2 und des Peptids Protegrin-1 sind
vergleichbar (Abb. 14). So starben 50 % der Zellen (LD50) bei der Histon H1.2
– Konzentration von 7,91 µg / ml (Abb. 14), wobei Protegrin-1 bei der
Konzentration von 12,5 µg/ml die gleiche Zytotoxizität (LD50) erreichte.
Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass die Zytotoxizität stärker
von der Peptidkonzentration als von der Inkubationsdauer abhängt.
Alexander Baraniskin Ergebnisse
49
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Peptidkonzentration (µg/ml)
vita
le K
erat
inoz
yten
(%)
6 h
12h
24h
Abbildung 14: Zytotoxizität des Histon H1.2 auf primäre humane
Keratinozyten. Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Histon
H1.2 für 6, 12 oder 24 Stunden inkubiert. Die y - Achse zeigt in Prozent den
Anteil der Zellen, die abhängig von den verschiedenen Peptidkonzentrationen
überlebt haben.
3. 2. In vivo Aktivität von Histon H1.2
Das infizierte Rattenverbrennungsmodell wurde angewendet, um die
antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vivo zu untersuchen. Das Histon
H1.2 wurde in drei unterschiedlichen Konzentrationen auf seine biologische
Aktivität überprüft: 25 µg / ml, 250 µg / ml und 2500 µg / ml.
Alexander Baraniskin Ergebnisse
50
Als Positivkontrolle wurde Protegrin-1 in der Konzentration von 250 µg / ml
eingesetzt und als Trägerkontrolle diente Phosphat gepuffte Kochsalzlösung
(PBS).
Um eine Infektion zu simulieren, wurde Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853; DSMZ 1117) appliziert. Die Sensibilität dieses Bakterienstammes gegen
Histon H1.2 und gegen Protegrin-1 wurde vorher mit dem Radiale - Diffusion -
Verfahren und mit dem Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs –
Verfahren kontrolliert.
Die Ergebnisse der mikrobiologischen in vivo Auswertung sind in der Abb. 15
dargestellt. Die niedrigste Histon H1.2 – Konzentration von 25 µg/ml ergab
keinen signifikanten Effekt verglichen mit den beiden anderen Versuchs-
gruppen. Histon H1.2 in der Konzentration von 250 µg / ml zeigte die höchste
antimikrobielle Aktivität. Die Anzahl der CFU pro Gramm Gewebe, das mit
dieser Histon H1.2 – Konzentration behandelt wurde, ist signifikant niedriger als
bei den mit der Trägerkontrolle (PBS) behandelten Geweben (p < 0,001) und
entsprach etwa den CFU - Mengen der mit der Positivkontrolle Protegrin-1
behandelten Geweben: 250 µg / ml Histon H1.2 8,93 x 1010 vs. 250 µg / ml
Protegrin-1 7,40 x 1010 CFU pro Gramm. Im Gegensatz zur 250 µg / ml –
Konzentration des Histon H1.2 wies die höchste eingesetzte Histon H1.2 –
Konzentration (2500 µg / ml) eine niedrigere antimikrobielle Aktivität auf (1,68 x
1011 CFU pro Gramm Gewebe).
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Histon H1.2 - Konzentration
von 250 µg / ml die optimale Konzentration für die Entwicklung einer effektiven
antimikrobiellen Wirkung zu sein scheint.
Alexander Baraniskin Ergebnisse
51
0
5
10
15
20
25
30
35
40
a b c Träger (PBS) Protegrin-1
Milli
onen
CF
U p
ro G
ram
m G
eweb
e
Abbildung 15: Antimikrobielle Bioaktivität im infizierten Rattenverbrennungs-
modell. Dieser Graph charakterisiert die Bakterienzahlen des Pseudomonas
aeruginosa in den Verbrennungswunden 4 Stunden nach intradermaler Injektion
von 25 µg / ml, 250 µg / ml oder 2500 µg / ml des Histon H1.2 und 250 µg /
ml des Protegrin-1 als Positivkontrolle und Phosphat gepuffte Kochsalzlösung
(PBS) als Trägerkontrolle. *,P < 0.05, Histon H1.2 (250 µg / ml) versus PBS
(Trägerkontrolle); #,P < 0.05, Histon H1.2 (2500 µg / ml) versus PBS (Träger-
kontrolle); +,P < 0.05, Protegrin-1 (250 µg / ml) versus PBS (Trägerkontrolle).
Histon H1.2
25 µg/ml
250 µg/ml
2500 µg/ml
#
* +
Alexander Baraniskin Diskussion
52
4. DISKUSSION
Es gibt eine zunehmende Anzahl von Erkenntnissen, die darauf hindeuten,
dass das angeborene Immunsystem eine Schlüsselrolle in der Infektabwehr
weit unterschiedlicher Spezies spielt. Diese Proteine sind essentielle
Komponenten des angeborenen Immunsystems. Sie agieren als
Effektorsubstanzen, die imstande sind ein breites Spektrum an Mikro-
organismen zu zerstören 7,21,37.
Das hochspezifische, erworbene Immunsystem ist nicht in der Lage effektiv
und schnell genug eine wirksame Schutzreaktion bei Konfrontation mit unter-
schiedlichen Erregerarten auszulösen. Es benötigt zur Aktivierung 4 bis 5
Tage 39. Im Gegensatz dazu hat das angeborene und phylogenetisch ältere Teil
des Immunsystems, die Fähigkeit rasch, und zwar innerhalb von Minuten, und
unspezifisch auf den Angriff eines Mikroorganismus zu reagieren 39. Auf diese
Weise ist das angeborene Immunsystem hauptsächlich für die „first line“ -
Abwehr verantwortlich. Es wird deutlich, dass im Gegensatz zum angeborenen,
das erworbene Immunsystem den Ausbruch einer Infektion nicht verhindern
kann. Eine effektive antimikrobielle Wirkung durch eine systemische Gabe von
bakteriziden Antibiotika tritt ebenfalls erst nach 6 bis 10 Stunden ein 13.
Viele der natürlich vorkommenden antimikrobiellen Proteine sind bereits
charakterisiert, wie z. B die Defensine, die Lysozyme und die Magainine 89. Auf
Grund der Ergebnisse dieser Studie müsste man in Zukunft auch das Histon
H1.2 zu den Effektormolekülen des angeborenen Immunsystems hinzurechnen.
Das Vorhandensein der antimikrobiellen Aktivität von Histonen ist nicht neu.
Bereits 1942 erwähnte Miller in „Antibacterial properties of protamines and
histone“, dass Histone eine antibiotische Aktivität besitzen 42.
Alexander Baraniskin Diskussion
53
Andere Studien bestätigten diese Tatsache anhand von Untersuchungen
unterschiedlicher Histonklassen. Park entdeckte das antimikrobielle Peptid
Buforin 1, das aus der Spaltung des Histon H2A durch eine spezifische
Protease entsteht 50,51. Über die potentielle Rolle des aus Epithelzellen
stammenden Histonproteins H1 in der angeborenen antimikrobiellen Abwehr
des humanen Gastrointestinaltraktes wurde bereits von Rose berichtet 22,61.
Die von unserer Arbeitsgruppe durchgeführten in vitro und in vivo
Untersuchungen bestätigten eindeutig die Existenz einer antimikrobiellen
Aktivität des Histon H1.2. Des weiteren konnte festgestellt werden, dass die
Wirksamkeit des Histon H1.2 weitgehend mit der des natürlich vorkommenden
antimikrobiellen Peptids Protegrin–1, welches über hervorragende antimikrobielle
Eigenschaften verfügt, übereinstimmt.
Sowohl die Ergebnisse des Radiale - Diffusion - Verfahrens als auch die
Ergebnisse des Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahrens
zeigten eine signifikant höhere antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 im
Vergleich zur Aktivität der Antibiotika, die derzeit klinisch gegen die
entsprechenden Bakterienstämme eingesetzt werden (ausgenommen
Vancomycin gegen MRSA). Ebenfalls offenbarte die Gegenüberstellung des
Histon H1.2 und des getesteten Antimykotikums Amphotericin B eine signifikant
stärkere antimykotische Aktivität des Histon H1.2.
Die minimale effektive Konzentration (MEC), ermittelt mit dem zweilagigen
Radiale - Diffusion - Verfahren, erwies sich gegen alle getesteten Mikro-
organismen als konstant: sowohl gegen die grampositiven als auch gegen die
gramnegativen Bakterien und gegen die getesteten Pilze.
Alexander Baraniskin Diskussion
54
Aus der Auswertung des Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs –
Verfahrens resultierten annähernd gleiche minimale inhibitorische
Konzentrationen (MIC), sowie gleiche minimale bakterizide Konzentrationen
(MBC) sowohl für grampositive, als auch für gramnegative Bakterien. Daraus
kann man folgern, dass das Histon H1.2 eine erregerunabhängige Wirkung
besitzt.
Die in vitro und in vivo Daten dieser Untersuchung zeigten, dass Histon H1.2
nicht nur eine stärkere Wirkung gegen beinahe jeden Mikroorganismus besitzt,
sondern außerdem ein viel breiteres Wirkungsspektrum gegen Bakterien und
Pilze aufweist, als alle aktuell klinisch eingesetzten Antibiotika. Es gibt derzeit
kein klinisch eingesetztes Antibiotikum mit so einem breiten Wirkungsspektrum
wie Histon H1.2.
Ein weiterer Vorteil des Histon H1.2 ist sein physiologisches Vorkommen in
jeder menschlichen Zelle, d. h. Histone sind für die menschliche Zelle keine
Fremdsubstanzen. Im extremen Gegensatz dazu stehen die derzeit
eingesetzten Antibiotika. Sie sind Pilzderivate, Pflanzenderivate oder andere für
menschliche Zellen fremde Substanzen, die eine Menge Nebenwirkungen
verursachen: allergische Reaktionen, gastrointestinale Beschwerden,
Embryonalschäden, Hepatotoxizität, Nephrotoxizität und viele andere
Komplikationen. Außerdem sind natürlich Resistenzen und Kreuzresistenzen zu
befürchten 55.
Bezüglich der hämolytischen Eigenschaften stellte sich ein großer Vorteil des
Histon H1.2 gegenüber dem Peptid Protegrin-1 heraus. In den Untersuchungen
zur Überprüfung der hämolytischen Aktivität wies Histon H1.2 die gleiche
minimale Schädigung der menschlichen Erythrozyten auf wie die zugelassenen
klinisch angewendeten Antibiotika.
Alexander Baraniskin Diskussion
55
Im Gegenteil dazu zeigte Protegrin-1 beträchtliche hämolytische Wirkung schon
im Bereich der effektiven antimikrobiellen Konzentration (100 % Zellzerstörung).
Auch die hämolytische Aktivität anderer antimikrobieller Peptide ist höher als
die des Histon H1.2. So zum Beispiel die hämolytische Aktivität von
α-Defensin, Magainin und Temporin 57,58.
Andererseits stellte sich heraus, dass Histon H1.2 bereits in niedrigen
Konzentrationen zytotoxisch wirkt. Zur Bestimmung der Zytotoxizität wurden
primäre humane Keratinozyten unterschiedlichen Histon H1.2 – Konzentrationen
ausgesetzt. Protegrin-1 wirkte etwas weniger zytotoxisch. Es ist nach wie vor
ungeklärt, weshalb Histon H1.2 auf der einen Seite die primären Keratinozyten
zerstört und auf der anderen Seite aber die wesentlich fragileren humanen
Erythrozyten wenig gefährdet. Ein möglicher Erklärungsansatz wäre, dass die
physiologischen Konzentrationen der endogenen extrazellulären Histone im Blut
erheblich höher sind als in den peripheren Geweben. Es kommt also
vermutlich zum aktiven Schutz der fließenden Blutzellen, unter anderem auch
der Erythrozyten. Die Membran der Erythrozyten besteht zwar wie die anderer
humaner Zellen aus der typischen Lipiddoppelschicht, mit eingelagerten
Proteinen, weist aber durch das zusätzliche Vorhandensein eines
Membranskeletts eine Strukturbesonderheit auf, die möglicherweise für die
Resistenz gegenüber Histon H1.2 verantwortlich ist. Das Membranskelett
besteht aus spezifischen Proteinen der Erythrozyten, wie zum Beispiel Spektrin
und Ankyrin 39. Es verhindert eventuell die Bindung der Histonproteine an die
Erythrozytenmembran. Es ist aber wahrscheinlicher, dass das Membranskelett
die Zellmembran so weit stabilisiert, dass die Histonproteine nicht in der Lage
sind, Poren in dieser einzubilden und so den Zelltod herbeizuführen.
Alexander Baraniskin Diskussion
56
Ein weiterer Faktor, der die Erythrozyten schützen könnte, ist der erhöhte
Protein- und Kohlenhydratanteil sowie der erniedrigte Lipidanteil der
Zellmembran im Vergleich zu anderen humanen Zellen. Es besteht folgende
Membranzusammensetzung: bei den Erythrozyten: Protein 49%; Lipid 43%;
Kohlenhydrat 8%. Bei anderen humanen Zellen, z. B bei Hepatozyten,
Endothelzellen, Keratinozyten und Granulozyten: Protein 45 %; Lipid 53 %;
Kohlenhydrat 2 % 39.
Die Ergebnisse anderer Studien zeigen, dass die Zytotoxizität anderer
antimikrobiellen Peptiden mit der des Histonproteins H1.2 vergleichbar ist. Dies
gilt unter anderem für Magainin, Melittin, α-Defensine und PR-39 48,57,58,59,70.
Die Resultate des infizierten Rattenverbrennungsmodells bestätigten grund-
sätzlich die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen. Es wurde gezeigt, dass
das antimikrobielle Potential des Histonproteins H1.2 demjenigen des
Protegrin–1 entspricht, und dass bei der Applikation von Histon H1.2 vier
Stunden nach der Wundinfektion die Erregermenge signifikant reduziert wurde.
Für die Applikation der getesteten Substanzen wählte man den Zeitpunkt von
vier Stunden nach der Infektion, weil es zu einem späteren Zeitpunkt zum
Überwachsen der Wunden durch Bakterien kommen würde. Durch das in vivo
Experiment fanden wir auch einen Anhaltspunkt dafür, in welchem Bereich die
optimale Wirkungskonzentration des Histonproteins H1.2 liegt, und zwar im
Bereich von 250 µg / ml. Eine Konzentration von 25 µg / ml erwies sich für
eine starke antimikrobielle Aktivität als zu niedrig. Dieses deutet darauf hin,
dass eine Schwellendosis hinsichtlich der antimikrobiellen Wirkung existieren
muss. Die Datenlage dieser Versuchsreihe lässt vermuten, dass die
Schwellendosis von Histon H1.2 zwischen 25 µg / ml und 250 µg / ml liegt.
Diese Ergebnisse korrelieren mit den Daten der beiden in vitro Versuche.
Alexander Baraniskin Diskussion
57
Des weiteren konnte bei einer Konzentration von 2500 µg / ml keine effektive
antimikrobielle Wirkung erzielt werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass
es ein therapeutisches Fenster existiert, bei dem aus einer Erhöhung der
Peptidkonzentration keine Wirkungsverstärkung, sondern sogar Wirkungs-
abnahme resultiert. Die Ursache für dieses unerwartete Ergebnis haben wir im
Rahmen unseres Versuchsvorhabens nicht aufgeklärt.
Die im Rahmen unseres Forschungsvorhabens ermittelte antimikrobielle
Wirksamkeit und hämolytische Aktivität von Protegrin–1 korrelieren mit den
Daten vorheriger Studien unserer Arbeitsgruppe 68,69,70. Unterschiede in den
Ergebnissen dieser Studie im Vergleich zu vorherigen Arbeiten könnten vor
allem dadurch erklärt werden, dass bei den in vitro Versuchen wie auch bei
dem in vivo Versuch andere Bakterienstämme verwendet wurden. Zusätzlich
unterscheidet sich die Durchführung unserer in vivo Untersuchungen von
denen, die vorher beschrieben wurden, durch die Verabreichung einer 100 –
fach größeren Bakterienmenge. Wir applizierten 1 x 108 CFU (Pseudomonas
aeruginosa) pro Wunde, anstatt von 1 x 106, wie in den anderen Studien 68,69,70.
Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist der Umstand, dass die
Experimente an einem anderen Ort und mit anderen Tieren durchgeführt
wurden 68,69,70. Man muss auch beachten, dass in unserem in vivo Experiment
die Reduktion der Bakterienzahl in der Verbrennungswunde gemessen wurde.
Aus diesem Grund sind unsere Ergebnisse nicht mit denen von Chalekson et
al vergleichbar, in denen die Mortalität der Versuchstiere bestimmt wurde 11.
Dabei setzte man den Ratten stärkere Verbrennungen zu. Und zwar wurden
23 % der Körperoberfläche für 10 Sekunden in 100°C heißem Wasser
verbrüht 11.
Alexander Baraniskin Diskussion
58
Aus früheren Studien ist auch bekannt, dass im Rattenverbrennungsmodell
Protegrin-1 eine signifikant stärkere antimikrobielle Bioaktivität als das derzeit
klinisch eingesetzte Antibiotikum Gentamicin besitzt 69. Dementsprechend haben
wir in den in vivo Versuchen als Positivkontrolle nur Protegrin-1 eingesetzt,
um die Anzahl der verwendeten Versuchstiere zu reduzieren.
Eine Frage, die immer noch unbeantwortet bleibt, ist die Frage nach der
physiologischen Bedeutung der antimikrobiellen Aktivität des Histon H1. Es
könnte folgendes Erklärungsmodell in Betracht kommen: Histone und ihre
Fragmente werden aus den Zellen freigesetzt, die durch Apoptose oder
Nekrose untergehen 53. Dies wurde von Frohm in “Biochemical and
antibacterial analysis of human wound and blister fluid” durch den Nachweis
der Histone und ihrer Fragmente in menschlicher Wundflüssigkeit gezeigt 17.
Dementsprechend führen Verletzungen zum Zelltod und damit auch zur
Freisetzung von Histonen. Den nachgewiesenen antimikrobiellen Eigenschaften
der Histone zufolge, hemmen diese signifikant das Bakterien- bzw.
Pilzwachstum und verhindern dadurch eine mögliche Infektion oder eine
weitere Ausbreitung der Infektion auf die umgebenden Zellen. Daraus folgt,
dass der Tod einzelner Zellen den Zellverband vor dem Untergang schützt.
Derart könnte einer der potentiellen Mechanismen der angeborenen
antimikrobiellen Abwehr durch Histone aussehen. Eine andere Möglichkeit wäre
eine aktive Sekretion oder Freisetzung der Histone während der
infektionsbedingten Apoptose 55.
Eine weitere interessante und vermutlich nützliche Eigenschaft des Histon H1.2
ist seine Fähigkeit Membranbestandteile von gramnegativen Bakterien bzw.
Lipopolysaccharide (LPS) zu binden und damit zu neutralisieren5.
Alexander Baraniskin Diskussion
59
Lipopolysaccharide interagieren unter anderem mit den Rezeptoren CD14 und
TLR4. Dadurch werden vor allem Monozyten / Makrophagen stimuliert TNF-α,
IL-6, IL-12 und andere proinflammatorische Zytokine zu produzieren5,8,19,23,72.
Auf diese Weise könnte Histon H1.2 zur Verhinderung des fatalen septischen
Schocks beitragen. Die Daten über die Interaktion von Histon H1.2 mit
Membranbestandteilen von grampositiven Bakterien liegen nicht vor.
Bereits im Jahre 1958 erwähnte Hirsch in „Bactericidal action of histone“, dass
Histone eine ungefähr zweifach stärkere antimikrobielle Aktivität bei pH 5,6 als
bei pH 7 besitzen 24. Da entzündetes Gewebe grundsätzlich im Vergleich zum
gesunden Gewebe einen niedrigeren pH – Wert besitzt, entfalten die Histone
unter Ausnutzung dieser für sie günstigeren Voraussetzung eine stärkere
Aktivität im erkrankten bzw. infizierten Gewebe.
Der Mechanismus, durch welchen das Histon H1.2 Bakterien und Pilze abtötet,
ist bislang nicht bis ins letzte Detail erforscht. Einiges spricht dafür, dass
Histon H1.2 und die antimikrobiellen Peptide den gleichen Wirkungs-
mechanismus haben. Sowohl Histon H1.2 als auch die meisten der bisher
bekannten antimikrobiellen Peptide sind positiv geladene polykationische
Peptide, die obligatorisch eine amphiphile Struktur enthalten 81. Auf der einen
Seite könnte die Sekundärstruktur des Histon H1, die für eine potente Bindung
an die stark negativ geladene DNA sorgt, zusätzlich für die Bindung an die
negativ geladene Bakterienoberfläche verantwortlich sein. Auf der anderen
Seite haben die antimikrobiellen Peptide, die in der Lage sind an die
Bakterienoberflächen zu binden, außerdem die Fähigkeit sich mit DNA zu
verbinden. Yonezawa zeigte, dass das antimikrobielle Peptid Tachyplesin I, das
aus dem Serum des chinesischen Pfeischwanzkrebses Tachypleus tridentatus
isoliert wurde, an DNA binden kann 87.
Alexander Baraniskin Diskussion
60
Ein weiterer Hinweis darauf, dass Histon H1 und die antimikrobiellen Peptide
den gleichen oder einen ähnlichen Wirkungsmechanismus besitzen, kommt von
Richards 55. Er zeigte in Untersuchungen mit dem Elektronenmikroskop, dass
Histon H1 die Bakterienmembran des getesteten Escherichia coli in der
gleichen Weise beschädigt, wie das antimikrobielle Peptid Magainin II vom
afrikanischen Frosch Xenopus laevis. Nach dem Zelltod war die Morphologie
den beiden unterschiedlichen Peptiden ausgesetzter Bakterien nicht
voneinander zu unterscheiden.
Der Wirkmechanismus des antimikrobiellen Peptids Magainin II und
wahrscheinlich des Histon H1 könnte folgendermaßen aussehen: alle
antimikrobiellen Peptide, die beim Menschen entdeckt wurden, sind positiv
geladen. Diese Eigenschaft führt zur Bindung der Peptide an die negativ
geladene Zelloberfläche der Bakterien (Abb. 16). Die hydrophilen Regionen der
Peptide ermöglichen die Bildung von Poren in der Zellmembran der Bakterien
31,80, die zum Kollaps des Membranpotentials, zur Steigerung der Membran-
permeabilität, zum Verlust von Ionen und damit schließlich zum Tod der
Bakterien führen 31,63.
Die Frage, wieso die menschlichen Zellen dabei nicht zerstört werden, ist
auch bereits teilweise beantwortet. Der Grund für die relative Spezifität dieses
Wirkungsmechanismus liegt vermutlich in den Eigenschaften von Zell-
membranen der Säugetierzellen. Sie sind schwächer negativ geladen und
haben einen höheren Cholesteringehalt als die Zellmembranen der meisten
Bakterien 62.
Alexander Baraniskin Diskussion
61
Abbildung 16: Wirkmechanismus vom Antimikrobiellen Peptid Protegrin-1: In
der Abbildung ist der bakterizide
Mechanismus von Protegrin-1 darge-
stellt. Protegrin–1 lagert sich mit dem
positiv geladenen Teil innerhalb weni-
ger Minuten direkt an die negativ
geladene prokaryontische Zellmembran
an. Die darauf folgende Einlagerung
ermöglicht die Bildung von trans-
membranösen Poren, die eine
Trennung der Innen - und Außen-
membran hervorrufen (1), eine Des-
organisation des Zytoplasmas verur-
sachen (2) und schließlich zum
Zelltod des Bakteriums mit leeren
Membrangerüsten (3) und extra-
zellulärem Debris führen(4) 69.
Die Bildung resistenter Keime gegen antimikrobielle Peptide ist ein überaus
seltenes Ereignis. Man versuchte eine Resistenz bei mehreren Bakterienarten
zu provozieren, indem man sie mit niedrigen, subinhibitorischen Dosen des
antimikrobiellen Peptids Pexiganan, einem Abkömmling des Magainin,
konfrontierte. Diese Versuche blieben erfolglos 71. Der genaue Grund, warum
es nicht häufiger zu Resistenzen kommt, ist bislang noch ungeklärt.
Wahrscheinlich lassen der äußerst schnelle Eintritt der Wirkung und der
Wirkungsmechanismus über Porenbildung das Auftreten von Mutationen, die zu
Resistenzen führen könnten, nicht zu. Man vermutet auch, dass die
antimikrobiellen Peptide an konservativen Strukturen der Erreger angreifen, die
sich im Laufe der Evolution nur minimal verändert haben und deren Änderung
nicht mit Leben und Wachstum der Mikroorganismen vereinbar ist 31.
Alexander Baraniskin Diskussion
62
Dafür spricht auch die Tatsache, dass Histonproteine gemeinsam mit
Cytochrom C zu den am stärksten konservierten Proteinstrukturen der
Säugetiere gehören 39. Die Primärstruktur der Histone blieb im Zuge der
Evolution praktisch unverändert, sodass sie sich beim Vergleich zwischen
verschiedensten Spezies nur um wenige Aminosäuren unterscheiden39. Daher
war es auch möglich, beim Tierexperiment mit Ratten das humane Histon
H1.2 einzusetzen.
Es wurde außerdem gezeigt, dass Histon H2A, aus dessen enzymatischen
Spaltung die antimikrobiellen Peptide Buforin I und II der asiatischen Kröte
Bufo bufo gargarizans und das Parasin des Katzenfisches P. asotus entstehen
53, einen anderen antimikrobiellen Wirkmechanismus aufweist. Dabei kommt es
nicht zur Bildung von Poren in der Zellmembran der Bakterien und zum
Kollaps des Membranpotentials, sondern zur Ansammlung des Peptids in der
Zelle und zur daraus folgenden Interaktion mit der bakteriellen DNA 55.
Die Ergebnisse dieser Studie verstärken die Annahme, dass Histon H1.2 ein
Protein ist, das die eukaryonten Lebewesen schon seit Millionen von Jahren
vor gefährlichen Infektionen schützt. In Zukunft könnte daraus eine Ergänzung
oder eine Alternative zu den derzeit bekannten Antibiotika entstehen.
Ein besonderer Schwerpunkt in der klinischen Anwendung des Histon H1.2
könnten lokale oder systemische Infektionen mit unterschiedlichen
Mikroorganismen sein. So beispielsweise bei Infektionen mit unterschiedlichen
Bakterienstämmen oder sogar mit unterschiedlichen Erregerspezies: mit Pilzen
und Bakterien. Ein idealer Anwendungsbereich wäre die Behandlung von
Brandwunden – auch wegen des typischerweise breiten und vom Wundalter
abhängigen Erregerspektrums.
Alexander Baraniskin Diskussion
63
Denn direkt nach der Verbrennung ist die Wundoberfläche aufgrund der
Hitzeeinwirkung steril. Doch bereits innerhalb von 48 Stunden wird sie von
grampositiven Bakterien besiedelt, die von den Haarfollikeln und aus der
Umgebung einwandern. Zwischen dem vierten und dem siebten Tag werden
diese Bakterien durch stärker virulente gramnegative Bakterien ersetzt. Nach
ungefähr einer Woche kommt es meistens zur Besiedlung mit Pilzen, vor
allem mit Candida albicans 18.
Eine überaus niedrige hämolytische Aktivität des Histon H1.2 erhöht die
Wahrscheinlichkeit, dass dieses Protein bei einer systemischen Applikation
keine oder nur geringe Nebenwirkungen verursacht. Das infizierte
Rattenverbrennungsmodell war auf eine topische Applikationsform beschränkt.
Aus diesem Grund könnte der nächste Schritt der Histon H1.2 –
Untersuchungen ein Nachweis der antimikrobiellen Wirkung des Histonproteins
H1.2 bei systemischen Infektionen sein. Des weiteren müsste man zunächst
durch Tierversuche und später in klinischen Studien herausfinden, welche
unerwünschten Wirkungen eine systemische Anwendung des Histon H1.2 mit
sich bringt.
Wir wissen bereits, dass das Histon H1.2 und die meisten antimikrobiellen
Peptide denselben Wirkmechanismus besitzen. Aufgrund dessen könnte man
weiteren Vermutungen nachgehen, dass Histon H1.2 noch andere, für den
Menschen nützliche, Eigenschaften der antimikrobiellen Peptide besitzt. Man
könnte überprüfen, ob Histon H1.2 wie die Cathelizidine in der Lage ist, die
Angiogenese zu stimulieren und die Wundheilung zu beschleunigen oder ob
es wie LL37 und humane Defensine, das Immunsystem triggern kann 2,31.
Alexander Baraniskin Diskussion
64
Ein weiterer Forschungsschwerpunkt könnte die Untersuchung der antiviralen
Aktivität des Histon H1.2 sein, die bei α - Defensinen 1 bis 3 gegen HIV
demonstriert wurde 92.
Die aktuellen klinischen Studien und die Ergebnisse dieser Arbeit machen uns
sehr optimistisch, dass mit Hilfe der physiologisch im Körper vorkommenden
Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems in Zukunft eine wirkungsvolle
Therapiealternative für Wundinfektionen entwickelt werden kann.
Alexander Baraniskin Zusammenfassung
65
5. ZUSAMMENFASSUNG
Die Haut ist ein wichtiger Schutzschild des menschlichen Körpers gegen
pathogene Mikroorganismen. Verbrennungen, die diesen Schutzschild zerstören,
und die daraus resultierende Immunsuppression prädisponieren Schwerbrand-
verletzte zu Wundinfektionen durch unterschiedliche Mikroorganismen mit hoher
Sepsisgefahr.
Im Rahmen dieser Studie sollte untersucht werden, ob rekombinantes
humanes Histon H1.2 als Lokaltherapie von Wundinfektionen einsetzbar ist.
Es wurden die antimikrobiellen Eigenschaften des Histon H1.2 in vitro
charakterisiert. Zudem wurden sowohl die hämolytische als auch die
zytotoxische Aktivität des Histon H1.2 bestimmt. In diesen Versuchsreihen
verglichen wir das Histon H1.2 mit dem antimikrobiellen Peptid Protegrin-1 und
mit klinisch eingesetzten Antibiotika und Antimykotika. Im weiteren Verlauf
wurde in einem infizierten Rattenverbrennungsmodell die antibakterielle Aktivität
von Histon H1.2 (25 µg/ml, 250 µg/ml und 2500 µg/ml) mit derjenigen von
Protegrin–1 (Positivkontrolle) und PBS (Trägerkontrolle) verglichen.
Das humane Histon H1.2 zeigte ausnahmslos eine signifikant stärkere
antimikrobielle Aktivität im Vergleich zu den klinisch eingesetzten Antibiotika
und Antimykotika bei praktisch fehlender hämolytischer Aktivität. In den in vivo
Versuchen konnte eine signifikante Reduktion der Bakterienzahl in den
infizierten Verbrennungswunden gezeigt werden.
Aufgrund der Ergebnisse dieser Studie sollte das Histon H1.2 künftig zu den
Effektormolekülen des angeborenen Immunsystems gezählt werden.
Alexander Baraniskin Literatur
66
6. LITERATUR
1. Albig W, Kardalinou E, Drabent B, Zimmer A, and Doenecke D.
(1991). Isolation and characterization of two human H1 histone genes
within clusters of core histone genes. Genomics 10: 940 - 8.
2. Bals R, Wilson J. M. (2003). Cathelicidins - a family of multifunctional
antimicrobial peptides. Cell Mol Life Sci 60 (4): 711 - 720.
3. Barnes P. J, Ito K, Adcock I. M. (2004). Corticosteroid resistance in
chronic obstructive pulmonary disease: inactivation of histone
deacetylase. Lancet. 28; 363 (9410): 731 - 733
4. Boecker W, H Denk, Ph. U. Heitz (2001). Pathologie, Urban & Fischer
Verlag, 2 Auflage; 61 – 67
5. Bolton, S. J., and V. H. Perry. (1997). Histone H1; a neuronal protein
that binds bacterial lipopolysaccharide. J Neurocytol 26: 823 - 31.
6. Bolton, S. J., M. Russelakis - Carneiro, S. B etmouni, and V. H.
Perry. (1999). Non - nuclear histone H1 is upregulated in neurones and
astrocytes in prion and Alzheimer's diseases but not in acute
neurodegeneration. Neuropathol Appl Neurobiol 25: 425 - 32.
Alexander Baraniskin Literatur
67
7. Boman, H. G. (1995). Peptide antibiotics and their role in innate
immunity. Annu Rev Immunol 13: 61 - 92.
8. Brackett, D. J., M. R. Lerner, M. A. Lacque ment, R. He, and H. A.
Pereira. (1997). A synthetic lipopolysaccharide - binding peptide based
on the neutrophil - derived protein CAP37 prevents endotoxin - induced
responses in conscious rats. Infect Immun 65: 2803 - 11.
9. Brix, K., W. Summa, F. Lottspeich, and V. H erzog. (1998).
Extracellularly occurring histone H1 mediates the binding of thyroglobulin
to the cell surface of mouse macrophages. J Clin Invest 102: 283 - 93.
10. Burlingame, R. W., W. E. Love, B. C. Wang, R. Hamlin, H. X.
Nguyen, and E. N. Moudrianakis. (1985). Crystallographic structure of
the octameric histone core of the nucleosome at a resolution of 3.30 A.
Science 228: 546 - 53.
11. Chalekson C. P, Neumeister M. W, Jaynes J. (2002) Improvement in
Burn Wound Infection and Survival with Antimicrobial Peptide D2A21
(Demegel). Plast. Reconst. Surg. 109 (4): 1338 - 1342
12. Class, R., S. Lindman, C. Fassbender, H . P. Leinenbach, S. Rawer,
J. G. Emrich, L. W. Brady, and M. Zeppezaue r. (1996). Histone H1
suppresses tumor growth of leukemia cells in vitro, ex vivo and in an
animal model suggesting extracellular functions of histones. Am J Clin
Oncol 19: 522 - 31.
Alexander Baraniskin Literatur
68
13. Classen M, V. Diehl, K. Kochsiek (2004). Innere Medizin, Urban &
Schwarzenberg Verlag, 5 Auflage; 276 – 288
14. Dimitrov, S., and A. P. Wolffe. (1996). Remodeling somatic nuclei in
Xenopus laevis egg extracts: molecular mechanisms for the selective
release of histones H1 and H1(0) from chromatin and the acquisition of
transcriptional competence. Embo J 15: 5897 - 906.
15. Early A, Drury L. S, Diffley J. F . (2004). Mechanisms involved in
regulating DNA replication origins during the cell cycle and in response
to DNA damage. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 29; 359 (1441):
31 – 38
16. Feyzi R, Hassan ZM, Mostafaie A. (2003). Modulation of CD (4) (+) and
CD (8) (+) tumor infiltrating lymphocytes by a fraction isolated from shark
cartilage: shark cartilage modulates anti - tumor immunity. Int
Immunopharmacol; 3 (7): 921 - 6
17. Frohm, M., H. Gunne, A. C. Bergman, B. Agerberth, T. Bergman, A.
Boman, S. Liden, H. Jornvall, and H. G. Bom an. (1996). Biochemical
and antibacterial analysis of human wound and blister fluid. Eur J
Biochem 237: 86 - 92.
18. Goodwin C W, B. A. Pruitt, I. N. Burns, M Kagan et al (1980).
Antimicrobial Therapy, Philadelphia, Pa: WB Saunders
Alexander Baraniskin Literatur
69
19. Gough, M., R. E. Hancock, and N. M. Kelly. (1996). Antiendotoxin
activity of cationic peptide antimicrobial agents. Infect Immun 64: 4922 -
7.
20. Grossbach, U. (1995). Selective distribution of histone H1 variants and
high mobility group proteins in chromosomes. Semin Cell Biol 6: 237 -
46.
21. Hancock, R. E., and M. G. Scott. (2000). The role of antimicrobial
peptides in animal defenses. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 8856 -
8861.
22. Hecht, G. (1999). Innate mechanisms of epithelial host defense:
spotlight on intestine. Am J Physiol 277: C351 - 8.
23. Hirata, M., Y. Shimomura, M. Yoshida, S. C. Wright, and J. W.
Larrick. (1994). Endotoxin - binding synthetic peptides with endotoxin -
neutralizing, antibacterial and anticoagulant activities. Prog Clin Biol Res
388: 147 - 59.
24. Hirsch, J. G. (1958). Bactericidal action of histone. J Exp Med 108:
925 - 44.
25. Holers, V. M., and B. L. Kotzin. (1985). Human peripheral blood
monocytes display surface antigens recognized by monoclonal
antinuclear antibodies. J Clin Invest 76: 991 - 8.
Alexander Baraniskin Literatur
70
26. Hospital Hygiene. (2002). Urban & Fischer Verlag, 4. Edition, p. 33 ff
27. Huang R. C, Bonner J. ( 1962). Histone, a suppressor of chromosomal
RNA synthesis. Proc. Nat. Acad. Sci. US 48: 1216 - 22
28. Kim K. C, Huang S. ( 2003). Histone methyltransferases in tumor
suppression. Cancer Biol Ther. 2 (5): 491 - 499
29. Kang J. A, Kim J. T, Song H. S, Bae M. K, Y i E. Y, Kim K. W, Kim
Y. J. (2003). Anti - angiogenic and anti - tumor invasive activities of
tissue inhibitor of metalloproteinase - 3 from shark, Scyliorhinus torazame.
Biochim Biophys Acta; 17; 1620 (1-3): 59-64
30. Khorasanizadeh S. (2004) The nucleosome: from genomic organization
to genomic regulation. Cell. 23; 116 (2): 259 - 272
31. Koczulla A. R., R. Bals (2003). Antimicobial Peptides. Drugs 63: 389 -
406
32. Krippner, H., B. Springer, S. Merle, and K. Pirlet. (1984). Antibodies
to histones of the IgG and IgM class in systemic lupus erythematosus.
Clin Exp Immunol 58: 49 - 56.
33. Laemmli U. P. (1970). Cleavage of structural proteins during the
assembly of the Head of bacteriophage T4. Nature 227: 680 - 685
Alexander Baraniskin Literatur
71
34. Langst G, Becker P. B. (2004). Nucleosome remodeling: one
mechanism, many phenomena? Biochim Biophys Acta. 15; 1677 (1 - 3):
58 - 63
35. Larrick J. W, Hirata M, Balint R. F, Le e J, Zhong J, Wright S. C.
(1995). Human CAP - 18: a Novel Antimicrobial Lipopolysaccharide –
Binding Protein Infection and Immunity. Apr. 63 (4); p. 1291 – 1297
36. Leak, A. M., and P. Woo. (1991). Juvenile chronic arthritis, chronic
iridocyclitis, and reactivity to histones. Ann Rheum Dis 50: 653 - 7.
37. Lehrer, R. I., and T. Ganz. (1999). Antimicrobial peptides in mammalian
and insect host defence. Curr Opin Immunol 11: 23 - 7.
38. Levy S. B. (1997). Antibiotic resistance: an ecological imbalance. Ciba
Found Symp. 2071 - 2079
39. Löffler G, Petrides P. E. (1998). Biochemie und Pathobiochemie
Springer – Lehrbuch 6. Auflage: 157-160
40. Matthews J. G, Ito K, Barnes P. J, Adcoc k I. M. (2004). Defective
glucocorticoid receptor nuclear translocation and altered histone
acetylation patterns in glucocorticoid – resistant patients. J Allergy Clin
Immunol. 113 (6): 1100-1108
Alexander Baraniskin Literatur
72
41. McKinsey T. A, Olson E. N. (2004). Cardiac histone acetylation –
therapeutic opportunities abound. Trends Genet. 20(4): 206 - 213
42. Miller B, R. Abrams, A. Dorfman, M. Kle in (1942). Antimibacterial
properties of protamines and histone. Science: 96; 428 - 430
43. Minota, S., H. Miura, Y. Misaki, K. Yamamoto , N. Morino, H.
Sakurai, A. Yamada, and Y. Yazaki. (1992). Relationship between
autoepitope and DNA - binding site on a histone H1 molecule.
Autoimmunity 13: 261 - 4.
44. Multigner, L., J. Gagnon, A. Van Dorsselaer, and D. Job. (1992).
Stabilization of sea urchin flagellar microtubules by histone H1. Nature
360: 33 - 9.
45. Nakagawa T, Ma B. Y, Uemura K, Oka S, Kawasak i N, Kawasaki T.
(2003). Role of mannan-binding protein, MBP, in innate immunity. Anticancer
Res. Nov - Dec; 23 (6a): 4467 - 71
46. Nemeth A, Langst G. (2004). Chromatin higher order structure: opening
up chromatin for transcription. Brief Funct Genomic Proteomic. 2(4): 334
- 343
47. Norbury C. J, Zhivotovsky B. (2004). DNA damage - induced apoptosis.
Oncogene. 12; 23 (16): 2797 - 2808
Alexander Baraniskin Literatur
73
48. Ohsaki Y, Gazdar A. F, Chen H. C, Johnson B. (1992). Antitumor
activity of Magainin analogues against human lung cancer cell lines.
Cancer Res. 52: 3534 - 3538
49. Ortega MR, Ganz, T, and Milner, SM (2000). Human beta defensin is
absent in burn blister fluid. Burns 26 (8): 724 - 726
50. Park, C. B., M. S. Kim, and S. C. Kim . (1996). A novel antimicrobial
peptide from Bufo bufo gargarizans. Biochem Biophys Res Commun
218: 408 - 13.
51. Park, C. B., K. S. Yi, K. Matsuzaki, M. S. Kim, and S. C. Kim.
(2000). Structure - activity analysis of buforin II, a histone H2A - derived
antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell -
penetrating ability of buforin II. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 8245 -
8250.
52. Parseghian, M. H., and B. A. Hamkalo. (2001). A compendium of the
histone H1 family of somatic subtypes: an elusive cast of characters
and their characteristics. Biochem Cell Biol 79: 289 - 304.
53. Patrzykat A, L. Zhang, V. Mendoza, G. K. Iw ama, R. E. V. Hancock
(2001). Synergy of Histone – Derived Peptides of Coho Salmon with
Lysozyme and Flounder Pleurocidin. Antimicrob Agents Chemother 48:
5; 1337 – 1342
Alexander Baraniskin Literatur
74
54. Pohlmeyer, K., J. Broer, G. Mayer, E. Gu mz, F. Wiederhold, A.
Caliebe, R. Wick, H. Siede, W. Muhlhard, B. Behnke, and J. Beuth.
(2000). The recombinant human histones H1 zero and H1.2 cause
different toxicity profiles on the human leukemia cell line K562.
Anticancer Res 20: 2499 - 503.
55. Richards R. C, D. B. O`Neil, P. Thibault, K . V. Ewart (2001). Histone
H1: An antimicrobial Protein of Atlantic Salmon (Salmo salar) Biochem
Biophys Res Commun 284: 549 - 55.
56. Richmond, T. J., J. T. Finch, B. Rushton, D . Rhodes, and A. Klug.
(1984). Structure of the nucleosome core particle at 7 A resolution.
Nature 311: 532 - 7.
57. Rinaldi A. C., Mangoni M. L, Rufo A, Luzi C, Barra D, Zhao H,
Kinnunen P. K. J, Bozzi A, Di Giulio A, Simma co M. (2002). Temporin
L: antimicrobial, haemolytic and cytotoxic activities, and effects on
membrane permeabilization in lipid vesicles. Biochem. J. 368: 91 - 100
58. Risso A, Braidot E, Sordano M. C, Vinel lo A, Macri F, Skerlavaj B,
Zanetti M, Gennaro R, Bernardi P. (2002). BMAP - 28, an antibiotic
peptide of innate immunity, induces cell death through opening of the
mitochondrial permeability transtition pore. Mol. Cell. Biol. 22: 1926 -
1935
Alexander Baraniskin Literatur
75
59. Risso A, Zanetti M. Gennaro R. (1998). Cytotoxicity and apoptosis
mediated by two peptides of innate immunity. Cell. Immunol. 189: 107 -
115
60. Ritonja A, Kopitar M, Jerala R, Turk V. (1989). Primary structure of a
new cysteine proteinase inhibitor from pig leucocytes. FEBS Lett. Sep
25; 255 (2): 211 - 214.
61. Rose, F. R., K. Bailey, J. W. Keyte, W. C. Chan, D. Greenwood,
and Y. R. Mahida. (1998). Potential role of epithelial cell - derived
histone H1 proteins in innate antimicrobial defense in the human
gastrointestinal tract. Infect Immun 66: 3255 - 63.
62. Schröder J. M. (2002). Antimikrobielle Peptide: Effektormoleküle der
Haut als Abwehrorgan. Hautarzt 53: 424 – 435
63. Shai, Y. (2002). Mode of action of membrane active antimicrobial
peptides. Biopolymers 66: 236 - 48.
64. Shen, X., and M. A. Gorovsky. (1996). Linker histone H1 regulates
specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell 86:
475 - 83.
Alexander Baraniskin Literatur
76
65. Solioz N, U. Bum – Tirouvanziam, R. Jacquet, S. Rafati, G. Corradin,
J. Mauel, N. Fasel. (2000). The protective capacities of Histone H1
against experimental murine cutaneous leishmaniasis. Vaccine: 18; 850 -
859,
66. Stehen M. (1998). Präklinische Diagnostik und Erstversorgung bei
Notfallpatienten mit Verbrennungen. Notfallmedizin 23: 17 – 23
67. Steinberg, D. A., and R. I. Lehrer. (1997). Designer assays for
antimicrobial peptides. Disputing the "one - size - fits - all" theory. Methods
Mol Biol 78: 169 - 86.
68. Steinstraesser, L., O. Burghard, J. Nemzek, M . H. Fan, A. Merry, D.
I. Remick, G. L. Su, H. U. Steinau, and S. C. Wang. (2003).
Protegrin-1 increases bacterial clearance in sepsis but decreases
survival. Crit Care Med 31: 221 - 6.
69. Steinstraesser L, R. D. Klein, A. Aminlari, M. H. Fan et al (2001).
Protegrin-1 enhances bacterial killing in thermally injured skin. Crit Care
Med 29: 1431 – 1437
70. Steinstraesser, L., B. F. Tack, A. J. Waring , T. Hong, L. M. Boo, M.
H. Fan, D. I. Remick, G. L. Su, R. I. Leh rer, and S. C. Wang.
(2002). Activity of novispirin G10 against Pseudomonas aeruginosa in
vitro and in infected burns. Antimicrob Agents Chemother 46: 1837 - 44.
Alexander Baraniskin Literatur
77
71. Steinstraessser L, Oezdogan Y, Wang S. C, Ste inau H. U. (2004). Host
defense peptides in burns. Burns Nov; 30 (7): 619 - 627
72. Steinstraesser L. (2004). Sepsis - New strategies with host defense
peptides? Crit Care Med. 32 (12): 2555 - 2556
73. Storici P, Zanetti M. (1993). A novel cDNA sequence encoding a pig
leukocyte antimicrobial peptide with a cathelin – like pro - sequence.
Biochem Biophys Res Commun. Nov 15; 196 (3): 1363 - 1368.
74. Taganov K. D, Cuesta I, Daniel R, Cirillo L . A, Katz R. A, Zaret K.
S, Skalka AM. (2004). Integrase – specific enhancement and suppression
of retroviral DNA integration by compacted chromatin structure in vitro. J
Virol. 78 (11): 5848 - 5855
75. Tamelis A, Bagdonas R, Rimdeika R. (2003). Staphylococcus aureus
infection in the surgery of burns. Medicina 39 tomas, Nr. 11
76. Tani M, Ito J, Nishioka M, Kohno T, Tachi bana K, Shiraishi M,
Takenoshita S, Yokota J. (2004). Correlation between histone
acetylation and expression of the MYO18B gene in human lung cancer
cells. Genes Chromosomes Cancer. 40(2): 146 - 151
Alexander Baraniskin Literatur
78
77. Thastrom A, Bingham L. M, Widom J. (2004). Nucleosomal locations
of dominant DNA sequence motifs for histone - DNA interactions and
nucleosome positioning. J Mol Biol. 7 ;338 (4): 695 - 709
78. The Brooklyn Antibiotic Resistance Task Force (2002). Infect Control
Host Epidemiol 23: 106 – 108
79. Treherne M. (2002). The Use of strategic outsourcing to speed up
discovery research. Drug Discovery
80. van 't Hof, W., E. C. Veerman, E. J. Helme rhorst, and A. V.
Amerongen. (2001). Antimicrobial peptides: properties and applicability.
Biol Chem 382: 597 - 619.
81. Vila, R., I. Ponte, M. A. Jimenez, M. Rico, and P. Suau. (2000). A
helix - turn motif in the C - terminal domain of histone H1. Protein Sci 9:
627 - 36.
82. Vermeulen M, Stunnenberg H. G. (2004). An in vitro assay to study
the recruitment and substrate specificity of chromatin modifying enzymes.
Biol Proced Online. 6: 157–162
Alexander Baraniskin Literatur
79
83. Wakshull E, Brunke – Reese D, Lindermuth J, Fisette L, Nathans R.
S, Crowley J. J, Tufts J. C, Zimmerman J, Ma ckin W, Adams D. S.
(1999). PGG-glucan, a soluble beta - (1, 3) - glucan, enhances the oxidative
burst response, microbicidal activity, and activates an NF - kappa B – like
factor in human PMN: evidence for a glycosphingolipid beta - (1, 3) -
glucan receptor. Immunopharmacology Feb; 41 (2): 89 - 107
84. Wesierska - Gadek J, E. Penner, H. Lindner , E. Hitchman, G.
Sauerman. (1990). Autoantibodies against different Histone H1 subtypes
in systemic lupus erhythematosus sera. Arhtritis Rheum: 33; 1273 - 8,
85. Wolffe, A. P. (1994). Transcription: in tune with the histones. Cell 77:
13 - 6.
86. www.dg-endo.de Homepage der Deutschen Gesellschaft für Endondothir
e. V
87. Yonezawa A., J. Kuwahara, N. Fujii, and Y. Sugiura. (1992). Binding
of tachyplesin I to DNA revealed by footprinting analysis: significant
contribution of secondary structure to DNA binding and implication for
biological action. Biochemistry 31: 2998 - 3004.
88. Ying H, Ji X, Hart M. L, Gupta K, Saifuddin M, Zariffard M. R, Spear
G. T. (2004). Interaction of mannose - binding lectin with HIV type 1 is
sufficient for virus opsonization but not neutralisation. AIDS Res Hum
Retroviruses 20 (3): 327 - 335
Alexander Baraniskin Literatur
80
89. Zasloff, M. (2002). Antimicrobial peptides of multicellular organisms.
Nature 415: 389 – 395
90. Zasloff, M. (1987). Magainins, a class of antimicrobial peptides from
Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial
cDNA sequence of a precursor. Proc Natl Acad Sci U S A 84: 5449 -
5453.
91. Zellweger, G. (1986). Die Behandlung der Verbrennungen. Praktische
Hinweise für Diagnose, Therapie, Rehabilitation. Köln, 2. Aufl.
92. Zhang L, Yu W, He T, Yu J, et al (2003). Contribution of Human α -
Defensin 1, 2 and 3 to the Anti – HIV – 1 Activity of CD8 Antiviral
Factor. Science 298: 995
Alexander Baraniskin Danksagung
81
7. DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich ganz besonders Herrn Juniorprofessor Dr. med
Lars Steinsträsser danken, der die vorliegende Arbeit sowohl im praktischen
als auch im schriftlichen Teil hervorragend betreut und unterstützt hat.
Ein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hans - Ulrich Steinau und Herrn Prof. Dr. Sören
Gatermann für die Rahmenbedingungen, die diese Promotionsarbeit ermöglicht
haben.
Außerdem möchte ich für die Hilfe bei der Durchführung der Doktorarbeit Dr.
Frank Jacobsen, Janine Mertens, Dominik Mittler, Mohammadi – Tabrisi Ahmad,
Andrea Gerhards, und Michaela Soltau danken.
Ein besonderer Dank gilt Susanne Friedrich und Gottlieb Pazdzierny für die
Einführung und Hilfe bei der Durchführung der Experimente in der Abteilung
für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr – Universität – Bochum.
Alexander Baraniskin Publikationen
82
PUBLIKATIONEN Publikationen
- Jacobsen F, Baraniskin A , Mertens J, Mittler D, Mohammadi – Tabrisi
A, Soltau M, Steinau H. U, Steinstraesser L. Antimicrobial activity of
Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy. 2005 März,16
Präsentationen auf wissenschaftlichen Kongressen
- Baraniskin A , Pazdzierny G, Tabresi A. M, Lehnhardt M, Steinau H. U,
Steinstraesser L: Antimikrobielle Akivität von Histonen. 34 Jahrestagung
der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC), Freiburg 30
Sept. – 5 Okt 2003
- Steinstraesser L, Baraniskin A , Pazdzierny G, Lehnhardt M, Steinau H.
U: Antimikrobielle Aktivität von humanen Histonen im
Verbrennungsmodell. Deutsche Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungs-
verletzungen (DAV) 2004 Rottach – Egern 6.- 9. Januar 2004
- Jacobsen F, Baraniskin A , Lehnhardt M, Druecke D, Mittler D,
Mohammadi - Tabrisi A, Steinau H. U, Steinstraesser L: Antimicrobial
activity of human Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. 2nd
World Union of Wound Healing Societies Meeting, N003 p. 33, Paris, 8
– 13 July 2004
Alexander Baraniskin Publikationen
83
- Baraniskin A , Jacobsen F, Lehnhardt M, Mertens J, Mittler D,
Mohammadi – Tabrisi A, Soltau A, Steinau H. U, Steinstraesser L:
Antimicrobial activity of recombinant human Histone H1.2 in vitro and in
infected burn wounds. The plastic Surgery Research Council 49th annual
meeting, Univeristy of Michigan, Ann Arbor, Abstract 94 B, P 323. June
9 - 12, 2004
- Jacobsen F, Baraniskin A , J. Mertens, D. Mittler, A. Mohammadi -
Tabrisi, S. Schubert, M. Soltau, B. Behnke, S. Gatermann, M.
Lehnhardt, H. U. Steinau, L. Steinsträßer: Antimikrobielle Aktivität von
humanem Histon H1.2 im infiziertem Verbrennungsmodell 34
Jahrestagung der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen
(VDPC), Düsseldorf 22 – 25 Sept 2004
Alexander Baraniskin Lebenslauf
84
8. LEBENSLAUF Name: Baraniskin Alexander Geburtsdatum: 03. 09. 1979 Geburtsort: Donezk, Ukraine Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: verheiratet mit Maria Baraniskin, geb. Molchan Schulische Ausbildung: 09. 1986 – 12. 1993 Mittelschule in Donezk, Ukraine
01. 1994 – 06. 1994 Mittelschule in Meerane
08. 1994 – 05. 2000 Gymnasium, Reinoldus – und - Schiller in
Dortmund
Hochschulausbildung: Ab 10. 2000 Studium der Medizin an der Ruhr –Universität-
Bochum
08. 2002 Ärztliche Vorprüfung 08. 2003 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Auszeichnungen: 01. 2004 Gewinner des Fakultätpreises 2003 der
Medizinischen Fakultät der Ruhr–Uni-Bochum