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transcript
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Konzepte der Immunologiefür Naturwissenschaftler
(MOLIM-S1)
SS 2007
Humorale ImmunitätHumorale Immunität(Antikörper – Methoden & Anwendungen)
Prof. Hans-Martin JäckAbteilung für Molekulare Immunologiean der Medizinischen Klinik IIINikolaus-Fiebiger-ZentrumTel.: 09131-8535912E-Mail: HJAECK@molmed.uni-erlangen.de
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Prof. Dr. Hans-Martin JäckAbteilung für Molekulare Immunologie
an der Medizinischen Klinik III
Thema 2:
Antikörper - Anwendungen
SS 2005
HUMORALE IMMUNITÄT
• Ak/Ag-Reaktionen
• Gewinnung spezifischer AK
• Anwendungen – Diagnostik & Forschung
• Anwendungen – Therapie
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• Variable Region der H- und L-Kette definiert die Spezifität
• Konstante Region der H-Kette bestimmt die biochemischen und biologischen Eigen-schaften (Effektorfunktion)
VL
CL
VH
CH1
CH2
CH3
Antikörper sind bifunktionalAntikörper sind bifunktional
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Antikörper – Antigenreaktionen Antikörper – Antigenreaktionen
HV2 (CDR2)
Epitop – Bindungsstelle im Ag
Paratop – Bindungsstelle im AK
HV3 (CDR3)
HV1 (CDR1)
Aus Janeway: Immunobiology
Hypervariable (HV) Regionen (oder CDRs) der H- und L-Kette bilden das Paratop
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Wasserstoffbindungen Brückenbildung zwischen Sauerstoff- oder Stickstoffatomen von Antigen und Antikörper (Ag-O - H - O-Ak oder Ag-N - H - N-Ak)
Elektrostatische Kräfte entstehen, wenn sich positive und negative freie Ladungen auf Antigen und Antikörper gegenüber liegen
Van der Waals-Kräfte resultieren aus der Interaktion zwischen Elektronenwolken (Dipole)
Hydrophobe Wechselwirkungen basieren auf einer Verdrängung von Wasser- Molekülen durch apolare, hydrophobe Gruppen (aromatische Aminosäuren). Diese Bindungsart kann bis zu 50% der Bindungskräfte ausmachen.
WechselwirkungenWechselwirkungen
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kD = 10-5 Mol-1
Antigenbindungsstelledes Antikörpers
Epitop des Antigens B
Anziehungskräfte wirken nur über sehr kleine Distanzen
kD = 10-8 Mol-1
Antigenbindungsstelledes Antikörpers
Epitop des Antigens B
Nieder- und hochaffine AntikörperNieder- und hochaffine Antikörper
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Antigen (Antikörper generierend) Jede Substanz, die an einen Antigenrezeptor bindet. Antigenrezeptoren sind Immunglobuline und T-Zellrezeptoren
ImmunogenSubstanz, die nach Injektion oder Infektion eine Antikörperantwort auslöst
• Gut: Proteine und Kohlenhydrate• Schwach: DNA, Lipide, kurze Polypeptide• Negativ: Aminosäuren, Haptene
Hapten (Halbantigen)Kleines chemisch synthetisiertes Molekül, das an Rezeptor bindet, alleine aber keine Immunantwort auslöst. Immunogen nach Kopplung an Trägerprotein
Epitop bzw. immunogene DeterminanteDer Bereich eines Immunogens, der mit dem Antikörper interagiert (bei Proteinen: 6-8 Aminosäurereste)
Antigene – Definitionen und StrukturAntigene – Definitionen und Struktur
Aus: Kuby, Aus: Kuby, ImmunologyImmunology
B-Zell-EpitopeB-Zell-Epitope
Konformations-epitop
LinearesEpitop
Neo-Epitop
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B-Zell-Antigene - EinteilungB-Zell-Antigene - Einteilung
• Nach Herkunft Natürlich (Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, bakt. Toxine, Zellen) Synthetisch (Haptene, Polypeptide)
• Nach chemischen Gesichtspunkten Proteine Kohlenhydrate Nukleinsäuren Konjugierte Proteine (Hapten-Protein) Polypeptide Lipide
• Nach genetischer Beziehung zwischen Spender und Empfänger Autoantigen - aus dem zu immunisierenden Individuum Isoantigen - aus einem genetisch identischen (syngenen) Spender
(Inzuchtmäuse) Alloantigen - aus einem nichtverwandeten Spender derselben Spezies (Bl6,
Balb/c) Xenoantigen - aus einem Spender einer anderen Spezies
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Vergleich von B-Zell- und T-ZellepitopenVergleich von B-Zell- und T-Zellepitopen
BZR TZR
Ag
MH
C II
MH
C I
Antigen-prozessierung
und -präsentation
Au
s Ja
ne
wa
y
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AFFINITÄT• Maß für die Stärke der Wechselwirkung
zwischen einer Ag-Bindungsstelle (Paratop) auf dem AK und einem Epitop auf dem Antigen
• Gute Affinität:
ka = 10-8 - 10-10 M-1
• Mittlere Affinität:
ka = 10-5 - 10-7 M-1
AVIDITÄT• Maß für die Stärke, mit der ein
bivalenter Antikörper an ein intaktes polyvalentes Antigen (z.B. Bakterien und Viren) bindet
• Größer als Affinität
Affinität und AviditätAffinität und Avidität
http://www-immuno.path.cam.ac.uk/~immuno/part1/lec06/lec6_97.html
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“Natürliche Antigene, wie beispielsweise Viren oder Bakterien besitzen viele gleiche Antigen- Determinanten auf ihrer Oberfläche. Wenn ein multivalentes Antigen sich mit mehr als einer Fab-Region des Antikörpers verbindet, ist die entstehende Bindungsenergie beträchtlich grösser als die Summe der beteiligten Einzelbindungen, da sämtliche Ag-Ak Bindungen gleichzeitig aufgebrochen werden müssen, wenn Ag und Ak sich wieder trennen sollen. Falls eine Fab-Stelle loslässt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine andere Fab-Region des Ak gerade gebunden ist, recht gross, was die Bindungsstärke mehr als nur verdoppelt. Die Kraft, die ein solcher multivalentes Ag mit einem multivalenten Ak bindet nennt man Avidität, sie ist, wie in der Abbildung dargestellt zwischen 103 und 107 mal stärker als die entsprechende Affinität. Unter physiologischen Bedingungen spielt die Avidität eine wichtigere Rolle, im Labor findet jedoch die Affinität häufiger Verwendung”. Quelle: leider verloren gegangen
Avidität (eine weitere Erklärung)Avidität (eine weitere Erklärung)
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Polyklonale Antiseren Heterogenes Gemisch von Antikörper, die ver-
schiedene Epitope auf dem Immunogen erkennen
Immunisieren von Tieren mit Antigen in komplettem Freunds Adjuvans [besteht aus Mineralöl (→ Depot-wirkung) und abgetöteten Tuberkelbazil-len→(unspezifische Aktivierung von DZ u. M)]
Immunisierungen werden mehrmals wiederholt (Boosts)
Monoklonale Antikörper homogener Antikörper, der nur ein Epitop auf dem
Immunogen erkennt Immunisierung von Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen
oder (Mensch) Generierung von Hybridomen
Gewinnung spezifischer AntikörperGewinnung spezifischer Antikörper
Immunisierung von Labortieren mit AntigenenImmunisierung von Labortieren mit Antigenen
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Aus Kuby
Hypoxanthin
Hypoxanthin-Guanin-
Phospho-ribosyl-
transferase(HGPRT+)
Salvage Pathway
Thymidin
Thymidin-kinase (TK+)
De Novo
Nukleotide
DNA, RNA
Aminopterin blockiert De Novo Purin- und PyrimidinsyntheseMyelom
HGPRT +
Ig+
sterblich
Milz-B
HGPRT -
Ig-
unsterblich
Amin-opterin
PEG
Hybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler AntikörperHybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler Antikörper(Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984)(Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984)
HAT-Medium: Hypoxanthin, Aminopterin,
Thymidin
B-Zell/Myelom-Hybrid
Ig+
HGPRT +
unsterblich
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Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert.
Anti-isotypische AK(gegen Epitope in C-Regionen
der H- und L-Kette)
Antikörper gegen ImmunglobulineAntikörper gegen Immunglobuline
BALB/c
Gegen verschiedene AK-Klassen (iso)
C57Bl/6
Die konstante Region der H-Kette aus einer BALB/c-Maus (weiß) und einer C57Bl/6-Maus (schwarz) unterscheidet sich in einer Aminosäure verschiedene Allotypen codiert durch Varianten desselben Gens bzw. Allels)
BALB/c
Anti-allotypische AK(gegen ein bestimmtes Epitop
In C-Region)
Gegen verschiedene Formen eines bestimmten AK (allo)
Anti-idiotypische AK(gegen Epitope in V-Regionen
der H- und L-Kette)
Gegen eine bestimmte (private= idio) Form
eines AK
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Isolierung von VH und VL-DNA-Fragmenten aus B-Zellen mittels PCR
Klonierung der VH- und VL-Fragmente in Bakteriophagen-Vektoren
Transformation in E.coli
Isolierung spezifischer Antikörperphagen mittels Affinitätschromatographie oder ‚Panning‘ an immobilisiertem Antigen
B-Zellen aus immunisiertem
oder nicht-immuninisiertem
Tier
Phagenantikörper-Bücherei
Aus
Jan
eway
: Im
mun
obio
logy
AntikörperphagenAntikörperphagen
Klonierung in Phagenvektor
Isolierung durch Panning
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Natürlich vorkommender,
monospezifischer IgG-Antikörper
Rekombinante Manipulation
Antikörper und Antikörper (Ak)-FragmenteAntikörper und Antikörper (Ak)-Fragmente
C H1
V H
C L
V
L
CH3
CH2
F(ab’)2
Pepsin-verdau
Papain-verdau
Fab Fd(Fragment of
Domains)
DiabodyscFv(Single-chain Fragment
of Varibale regions)
Rekombinant in E.coli, Hefe und Insekten-
bzw. Säugetierzellen
BispezifischerIgG-Antikörper
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Muriner Ak
Humanisierter, chimärer Ak
Humaner Ak
Chimärer Ak
Sequenzen des Paratops (Hyper- varibale Region = CDR) im humanen Ak werden rekombinant durch entsprechende Sequenzen aus Maus-Ak ersetzt
Murine VH-Region
Humanisierte Maus-AntikörperHumanisierte Maus-Antikörper
Chimäre - feuerspeiendes Ungeheuer aus der griechischen Mythologie mit dem Kopf eines Löwen, dem Körper einer Ziege und dem Schwanz eines Drachen.
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Anwendungen von Antikörper in Anwendungen von Antikörper in Forschung und klinischer DiagnoseForschung und klinischer Diagnose
o Nachweis und Quantifizieren löslicher Moleküle
o Nachweis intrazellulärer und membrangebundener Proteine auf Einzelzellniveau
o Nachweis und Quantifizierung von Zellpopulationen innerhalb einer Zellsuspension
o Nachweis sezernierender Zellen
o Anreicherung und Isolierung definierter Zellpopulationen
o Proteinreinigung und Untersuchung von Proteinkomplexen
o Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen
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Nachweis und Quantifizierung löslicher MoleküleNachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle
In Lösung: Heidelberger TitrationskurveIn Lösung: Heidelberger Titrationskurve
Menge der Ak-Ag-Komplexe
Antigen-Konzentration
Antikörper-Konzentration
Aus Janeway: Immunobiology
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Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony
Antigen und Antiserum werden in Ver- tiefungen in der Agarmatrix pipettiert
Ag1 und Ag 3 haben keine gemeinsamen Epiotope, i.e., sie sind verschiedenen
Ag1 und Ag 2 besitzen identische Epiotope
Beispiel:
Antikörper Antigen
Agarmatrix Präzipitatslinie
Anfärben
Prinzip:
Aus Janeway: Immunobiology
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• Quantitativer Nachweis von Antigenen (z.B. Serum IgG)
• Antikörper wird in Agar eingegossen
• Antigen wird in Vertiefung gegebenDiffusion des Antigens
• Äquivalenzpunkt => Präzipitation
• Durchmesser des Präzipitationsrings ~ Konzentration
• Mitführen eines Ag-Standard
• Bestimmung der Ag-Konzentration aus Eichkurve
Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini)Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini)
Ak AgAk
Ag
Präzipitations-ring
Durch-messer
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OH N
H
H
H2O2
O N H
2 H2O
direkt „capture“indirekt
Enzym
Antigen
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Qualitativer und quantitativer Nachweis löslicher Moleküle mit spez. AK
Nachweis und Quantifizierung löslicher MoleküleNachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle
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Übliche Enzyme
Alkalische Phosphatase (AP)
Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase = HRP)
NOHH
HNO
H
H2O2 2 H2O
Konjugiertes -Elektronensystem ➙ farbigfarblos
OP N+
O
O-
N+OO-
gelbfarblos
OH-
OHO
O-
O-
PO
O-
O-
OH++ H2O
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Schwangerschaftsnachweis durch AgglutinationsinhibitionSchwangerschaftsnachweis durch Agglutinationsinhibition
HCG • human chorionic gonadotropin
Humanes Chorion-Gonadotropin
• Schwangerschaftshormon
• Wird zuerst von Blastozyste, dann von Plazenta gebildet
• Kann bereits 6-15 Tage nach der Befruchtung im Urin nachgewiesen werden
• Verantwortlich für morgentliches Erbrechen
Aus Janeway
nicht schwanger
schwanger
Kein HCG Im Urin
HCG Im Urin
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Blutgruppennachweis durch HämagglutinationsreaktionBlutgruppennachweis durch Hämagglutinationsreaktion
Agglutination:
Verklumpung korpuskulärer Bestandteile durch Anti-körper
Aus Janeway
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Nachweis von Antigenen in und auf ZellenNachweis von Antigenen in und auf Zellen
Photoimmunfluoreszenz
Durchflusszytometrie
Analyse eines Antigens auf Einzelzellbasis
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PhotoimmunfluoreszenzPhotoimmunfluoreszenz
AK
Zelle
Fluoro-chrom
(FITC)
+ AK
+ irrelevanter AK
Aus
Jan
eway
: Im
mun
obi
olog
y
28
Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellenauf der Oberfäche von Zellen
Au
s Ja
new
ay, Im
mu
nob
iolo
gy
Zellgöße
Granularität
Rot
Grün
z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz
FITC-anti-CD4 PE-anti-CD8
Zell-göße
Granularität
(Düse)
Photozellen
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FACS steht für Fluorescence activated cell sorting und beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Der Ausdruck "FACS" ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson. Der Name ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen
Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie.
Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahlpassiert.
Durchflusszytometrie und FACSDurchflusszytometrie und FACS
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Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellenauf der Oberfäche von Zellen
Au
s Ja
new
ay, Im
mu
nob
iolo
gy
Zellgöße
Granularität
Rot
Grün
z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz
Dot
plot
s
FI (FITC anti-CD8)
FI
(PE
an
ti-C
D4)
FITC-anti-CD8 PE-anti-CD4
Zel
lzah
l
His
togr
amm
Fluoreszenzintensität = FI ()
FL2-H
410
310
210
110
010
Cou
nt
200
150
100
50
0
FL1-H
410
310
210
110
010
Cou
nt
200
150
100
50
0
PE anti-CD4 FITC anti-CD8
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Quantitativer Nachweis sezernierender ZellenQuantitativer Nachweis sezernierender Zellen
Jerne-Plaque-Assay
Durchflusszytometrie
Elispot-Assay
Bestimmung der Frequenz sezernierender Zellen
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Hemolytischer (Jerne) Plaque AssayHemolytischer (Jerne) Plaque Assay(N. Jerne, A. Nordin & C. Henry)(N. Jerne, A. Nordin & C. Henry)
Aus Kuby, 4th edition
SRBC:sheep red blood cellsPFC: plaque-forming units
Plasmazelle
Bestimmung der Frequenz AK-sezernierender Plasmazellen in einer Milzzellkultur
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Nachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-TechnikNachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-Technik
Bestimmung der Frequenz Zytokin-sezernierender Milzzellen vor und nach Stimulierung
Aus
Jan
eway
4th
edi
tion
+-
Animation unter: http://www.elispot-analyzers.de/english/elispot-animation.html
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Durchflusszytometrischer Nachweis sezernierender ZellenDurchflusszytometrischer Nachweis sezernierender Zellen
Beispiel: Nachweis Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (Assay nach Milteny Biotech)
• Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen
• Zellen werden stimuliert IFN- wird sezerniert und von IFN--Catch abgefangen
• Gebundenes IFN- wird mit Fluorochrom-konjugierten (PE) anti- IFN- -Ak inkubiert
• Zellen können durchflusszytometrisch analysiert
• Alternativ können Zellen mit magne-tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN- sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden
PE
(PE anti-IFNγ)
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Isolierung definierter ZellpopulationenIsolierung definierter Zellpopulationen
Sortierung von Zellen anhand von OberflächenproteinenSortierung von Zellen anhand von OberflächenproteinenM
agne
tisch
e M
etho
de
(MA
CS
)
Dur
chflu
sszy
tom
etrs
iche
Met
hode
(F
AC
S)
Aus Janeway: Immunobiology
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Anreicherung sezernierter Zellen mittels der Anreicherung sezernierter Zellen mittels der FACS- oder MACS-TechnikFACS- oder MACS-Technik
Beispiel: Anreicherung Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (nach der FACS/MACS-Methode von Milteny Biotech)
• Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen
• Zellen werden stimuliert IFN- wird sezerniert und von IFN--Catch abgefangen
• Gebundenes IFN- wird mit Fluorochrom-konjugierten (PE) anti- IFN- -Ak inkubiert
• Zellen können durchflusszytometrisch analysiert
• und gleichzeitig durchflusszytometrisch sortiert werden
• Alternativ können Zellen mit magne-tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN- sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden
Magnetisierbareanti-PE-AK
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Proteinaufreinigung und Analyse von ProteinkomplexenProteinaufreinigung und Analyse von Proteinkomplexen
Aufreinigung von Proteinen mittels AffinitätschromatographieAufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
Aus Janeway: Immunobiology
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Immunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter PolypeptideImmunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter PolypeptideM
etab
olis
che
Mar
kier
ung
IgM-produzierende Zellen
Anti-H-Ak
kD
200
97
66 45
31
St 1 2
1. Zellkultur-Überstand2. Zell-Lysat
Autoradio- oder Fluorogramm
Aus Janeway: Immunobiology
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Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer kombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalysekombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalyse
Versuch: Untersuchung des Einflusses einer IgL-Kette auf die Interaktion einer IgH-Kette mit dem Chaperon BiP
Membran
IP: anti-IgH
Zelllysate aus H+ und H+L+ Plasmalinie
Ele
ktr
op
hore
se
SDS-Polyacyl-amidgel
Elektro-transfer
anti-IgH(1)
anti-BiP(2)
Enzym-konjugierte Sekundär-antikörper
HL H
IgH
Zelllinie
BiP
40
o Immundefizienz
o Entzündung
o Autoimmunität
o Infektion
o Krebs
Anwendungen von AK in der TherapieAnwendungen von AK in der Therapie
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Tumor- oder HIV-infizierte
Zelle
Tumorantigen oder Virales Hüllprotein
Modifizierte Antikörper als Virus- bzw- Modifizierte Antikörper als Virus- bzw- Tumortherapeutika Tumortherapeutika
kill
Killer-T-Zelle
killToxin/ Isotop
Immunotoxinoder
nativer AK
Immunotoxinoder
nativer AKTZR
Bispezifischer Antikörper
Bispezifischer Antikörper
Retuximab Anti-CD20 AK(B-Lymphome)
(http://www.prolife.de/aktuelles/38.html)
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Wirkmechanismen therapeutischer AntikörperWirkmechanismen therapeutischer Antikörper
5. Blockieren
1. Signalisieren
2. Antikörper-abhängigezellvermittelte Zyto-toxizität (ADCC)
3. Komplement-abhängigezell-vermittelte Zytotoxizität (CDC)
4. Transport zytotoxischer Substanzen
Promotionsvortrag 2007Dr. Michael SchwemmleinFAU Lehrstuhl für Genetik
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Katalytische Antikörper (Abzyme) Katalytische Antikörper (Abzyme) (Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986)(Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986)
ConventionalAntibody
Catalytic Antibody
Binds antigen butdoes not cleave
Is "used" up duringreaction
Binds antigen and cleaves it
Is regenerated after reaction
44L.C.Hsieh-Wilson, P.G.Schultz, and R.C.Stevens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5363-5367 (1996).
Periodatoxidation von p-Nitro-Toluol-methyl-Sulfid zu Sulfoxid
Instabiler ÜbergangszustandHapten
(Stabiles Analog zum Übergangszustand)
Amino-phosphonsäure
45
Enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Kokain (Landy and coworkers, New York 1993)
Cocaine Cleavage Products(inactive)(active)
NO
O O
OCH 3
H C3
HO
NO
OO
OCH 3H C3
HO
NO
OH
OOCH 3
H C3 HO
C
+
Unstable Transition State
NO
OO
OCH 3H C
3
HOP
Stable TransitionState Analog