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© W. Puppe
Multiplex-RT-PCR-ELISA
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©W. Puppe 2003. Universitätsklinikum Schleswig Holstein, Campus Kiel, Klinik für Allgemeine Pädiatrie, Schwanenweg 20, 24105 KIEL
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UK-SH / Campus KielAllgemeine Pädiatrie
Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
Mikrobiologische Labor der KinderklinikMikrobiologische Labor der Kinderklinik
Nachweis von Erregern
bei
Akuten Infektionen des Respirationstraktes
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Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
RT-PCR
- Nachweis viraler RNA durch reverse Transkription mit anschließender Polymerase Chain Reaction
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
Zielsequenz (RNA)Primer
Reverse Transkriptase
d-ATPd-CTPd-GTPd-TTP
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe
Primer
d-ATPd-CTPd-GTPd-TTP
ACGGTCTTGZielsequenz (RNA)
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
Primer
d-ATPd-CTPd-GTPd-TTP
ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTAZielsequenz (RNA)
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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PrimerACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTACACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGT
ERGEBNIS c-DNA
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
1 Kopiec-DNA
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
c-DNA denaturieren bei
94°C
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
c-DNA denaturieren bei
94°C
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
annealen von spezifischen Amplifikations-Primernan Einzel-Strang
50°C
Primer 1
Primer 23‘5‘
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Transkription durch Taq-Polymerase 72°C
Taq-Polymerase
d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP
Primer 23‘5‘
CA
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Taq-Polymerase
d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP
Primer 23‘5‘
CTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Transkription durch Taq-Polymerase 72°C
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Taq-Polymerase
d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP
Primer 23‘5‘
TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Transkription durch Taq-Polymerase 72°C
1. Zyklus1 Kopie
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Denaturieren 94°C
2. Zyklus
3‘5‘TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Denaturieren 94°C
2. Zyklus
3‘5‘
TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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annealing der Primer50°C
2. Zyklus
Primer 23‘5‘
d-ATP; d-CTP; d-GTP; d-TTP
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Primer 1
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Transkription mit Taq-Polymerase72°C
2ter Zyklus
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Primer 23‘5‘
Primer 1
TGGTACACTGCATTCCA
ACGGTCTTGCAA
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Transkription mit Taq-Polymerase72°C
2ter Zyklus
Primer 23‘5‘
ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAG
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Primer 1
CATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Transkription mit Taq-Polymerase72°C
2ter Zyklus
Primer 23‘5‘
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Primer 1
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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nach dem 2ten Zyklus
2 Kopien
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
3‘5‘CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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3ter Zyklus
94°C
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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3ter Zyklus
50°C
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Primer 2
Primer 2
Primer 1
Primer 1
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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3ter Zyklus
72°C
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Primer 2ACACTGCATTCCA
Primer 2ACACTGCATTCCA
Primer 1 ACGGTCTTGCAAT
Primer 1 ACGGTCTTGCAAT
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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3ter Zyklus
72°C
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Primer 2ACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Primer 2ACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGAT
Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGAT
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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4 Kopien nach 3tem Zyklus
72°C
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Primer 2CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Primer 2CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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nach dem 4ten Zyklus
8 Kopien
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAATGAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTACTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAATGAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTACTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAATGAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAATGAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAATGAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTACTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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nach dem 5ten Zyklus16 Kopien
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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in der Praxis erhält man nach21 bis 31 Zyklen
106 bis 109 Kopieneines Fragmentes welches auf der Zielsequenz
mit einem hoch spezifischen Primer Paar amplifiziert wurde
RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR
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Multiplex-RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
Verwendung von 14 + 5 Primer Paarendie spezifisch für hoch konservierte Zielsequenzen
der 19 Erreger sind
in einem RT-PCR-Ansatz
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Ergebnis einer m-RT-PCR
m-RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction- Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2% Agarose
501404331
242190147140
bp
3. entero virus (154)
4. M. pneumoniae (277)
5. Inf A (190)
6. Inf B (249)
1. standard
2. negative controle
7. adenovirus (134)
8. C. pneumoniae (463)
9. PIV1 (179)
10. PIV3 (205)
11. RSV (239)
12. B. pertussis
13. B. parapertussis
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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m-RT-PCR
- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction- Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel- Spezifizierung der Amplifikate im PCR-ELISA
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Primer 2
Primer 1
Primer 1
Primer 2
GCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
GCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA
ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC-------ACGTAG
ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC-------ACGTAG
d-UTP
d-UTP
Transkription mit Taq-Polymerase72°C
RT-PCR-ELISA
- Einbau von DIG-11-dUTP ( ) in die Amplifikate bei der PCR
3‘5‘
5‘3‘
GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA
CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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d-UTP
d-UTP
d-UTP
d-UTP
d-UTP
RT-PCR-ELISA
- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG
RT-PCR-ELISA
- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert )
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG
RT-PCR-ELISA
- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG
RT-PCR-ELISA
- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte- Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym )
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG
RT-PCR-ELISA
- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte- Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym )- Zugabe von Substrat
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG
RT-PCR-ELISA
- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte- Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym )- Zugabe von Substrat Farbentwicklung
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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RS
V S
on
de
Ev-Sonde
Mp-Sonde
InfA-Sonde
InfB-Sonde
Ad-Sonde
Cpn-Sonde
PIV3-Sonde
PIV1-Sonde
RS
V S
on
de
En
tero
vir
us
M.
pn
eu
mo
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Infl
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A
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PIV
1
PIV
3
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ne
g.
Prä
pa
rati
on
Ko
ntr
oll
en
RT-PCR-ELISA
- Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte)
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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RS
V S
on
de
Ev-Sonde
Mp-Sonde
InfA-Sonde
InfB-Sonde
Ad-Sonde
Cpn-Sonde
PIV3-Sonde
PIV1-Sonde
RS
V S
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1
PIV
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RS
V
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Ko
ntr
oll
en
2% Agarose
501404331
242190147140
bp
PIV1 (179)
PIV3 (205)
RSV(239)
Cpn (463)
Av(134)
InfB(249)
InfA(190)
Mpn(277)Ev
(154)
RT-PCR-ELISA
- Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte & Gel)
Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR
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Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel
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Multiplex-RT-PCR-ELISA
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Multiplex-RT-PCR-ELISA
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Multiplex-RT-PCR-ELISA
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Multiplex-RT-PCR-ELISA